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摘要背景<br>　　肺微血管内皮细胞（Pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）是肺气血屏障的重要组成结构，生理情况下维持人体正常的呼吸交换功能，其功能变化对维持血管正常结构以及肺组织损伤后的修复起重要作用。在肺纤维化（Pulmonaryfibrosis，PF）的形成过程中，成纤维细胞（Fibroblast，Fb）的激活及转化为肌成纤维细胞（Myofibroblast，MFb）是肺间质内基质成分过度沉积的关键因素。已经证实，肺内MFb有四种来源：间质内的Fb在炎细胞分泌细胞因子作用下转化成MFb；骨髓干细胞转化为MFb；肺泡上皮细胞间充质转分化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）；血管内皮细胞间充质转分化（Endothelial-mesenchymaltransition，EndoMT）。其中EndoMT在肺纤维化形成中的地位和作用已经引起广泛关注。<br>　　既往的研究中发现，PF患者及实验动物模型肺组织血管密度分布不均，在纤维化区周边存在异常的新生血管，而中心区血管退化[1]。增生的PMVECs分化不全，形成的微血管血液灌注不良，不能发挥正常的生理功能。我们前期实验发现，博莱霉素（Bleomycin，BLM）致PF大鼠PMVECs增殖活跃并分泌促纤维化的细胞因子，如转化生长因子-β1（Transforminggrowthfactor，TGF-β1）和结缔组织生长因子（Connectivetissuegrowthfactor，CTGF），而且与PMVECs共培养的Fbs可显著增加平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin，a-SMA）的表达[2]。目前，PMVECs的这种异常增殖、分泌致纤维化因子及EndoMT的调控因素不明。<br>　　Notch信号通路广泛参与机体发育、细胞分化及稳态调节。近年来发现，Notch对EC的增殖和分化具有重要的调节作用。Notch激活可通过抑制血管内皮生长因子受体2（Vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2/Flk-1/KDR）的表达特异性调控由VEGF诱导的EC增殖与分化，使血管正常发育并维护其生理功能。<br>　　综上所述，MFb是肺纤维化形成的标志性细胞，而MFb的来源，包括PMVECs来源的EndoMT，具有多样化的特点。基于Notch信号在调控增殖的微血管中的作用，我们假设BLM可能降低或损伤了多种细胞的Notch信号通路，致使其成为调控增殖状态的PMVECs及Fbs转化为EndoMT及MFb的前提和基础。<br>　　方法和目的<br>　　本实验采用气管内注入BLM诱导SD大鼠PF模型，气管内注入等体积生理盐水作为对照。分别于给药后第7天和第14天处死大鼠，取外周肺组织原代培养PMVECs和Fbs并鉴定，余肺组织常规固定、包埋、切片、VG染色。采用免疫组织化学法检测肺组织中Hes1、KDR的表达；细胞免疫荧光化学法检测PMVECs中PCNA的表达水平；蛋白印记（westernblot）、实时定量PCR（Real-timePCR）检测各组PMVECs中Notch信号通路重要分子Hes1、Notch1、Jag1、Dll4的蛋白及mRNA水平的表达；WesternBlot检测Fbs中Notch信号相关分子的蛋白表达水平；结合各组PCNA和α-SMA的表达情况，以明确PF时Notch信号通路发生的变化，以及对PMVECs和Fbs增殖、分化的影响。<br>　　结果<br>　　1.细胞免疫荧光及WesternBlot检测BLM组PMVECs的PCNA蛋白表达上调且α-SMA表达增加，免疫组织荧光显示BLM组肺内有共表达α-SMA和VWF的细胞存在，证实BLM大鼠PMVECs不仅处于增殖状态，而且表型已发生转变。<br>　　2.免疫组织化学、WesternBlot、Real-timePCR检测显示BLM组PMVECs的Hes1表达下调，KDR表达上调，Jag1表达明显上调，而Dll4表达较正常组低，提示肺纤维化时PMVECs的Notch信号通路抑制且配体表达异常。<br>　　3.WesternBlot检测显示BLM组Fbs的Hes1表达下调，Jag1上调，同时PCNA及α-SMA的表达水平增高，提示肺纤维化时Notch信号的抑制可能与MFb的产生有关。<br>　　结论<br>　　1.PMVECs的EndoMT及Fbs向MFb转分化可能是BLM大鼠肺纤维化形成的重要原因之一，而Notch信号通路抑制是BLM大鼠异常增殖的PMVECs及Fbs转分化为EndoMT及MFb的基础。<br>　　2.Notch配体Jag1高表达和Dll4低表达可能造成VEGF-Notch-KDR负反馈调节途径异常。<br>　　3.Jag1的高表达可能与Fbs的增殖及转分化有关。