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摘要本课题组近年来研究发现I型咪唑啉受体(I1R)可能是调节阿片依赖的重要分子之一,并提出了胍丁胺——I1R构成的作用系统可能是又一新的阿片功能调节系统这一学术观点。国内外研究表明,I1R候选蛋白(Imidazoline Receptor Antisera Selected protein,IRAS)可能是I1R或至少是I1R的重要功能亚基之一。然而,本课题组前期利用自制单克隆抗体对大鼠组织中IRAS分布进行研究时发现,除肝脏外,其它组织均未检测到全长形式(167KDa)的表达,且IRAS的胞内囊泡状亚细胞定位与放射自显影检测的I1R的细胞膜分布存在矛盾,I1R不同配体药理学作用也存在较大的差异。本课题组前期研究表明,IRAS可能存在多种可变剪接体形式,提出了“I1R的上述科学问题可能与存在的多种可变剪接体有关”的假说。<br>　　本课题拟首先应用生物信息学预测I1R可能存在的可变剪接体及可能发生剪接的位置,虚拟研究可变剪接体的分子构成和功能;在此生物信息学研究的基础上,用分子生物学和细胞生物学技术对IRAS进行短截突变,扩增与预测可变剪接体有相似功能结构域的短截突变体,并构建相应的真核表达载体;从亚细胞定位和分子量特征两方面初步了解短截突变体的结构与功能,以此推测I1R可变剪接体的功能;在此基础上,结合本课题组前期研究,克隆GenBank号为AK036043(本课题中命名为Nischarin472)和AK086880(Nischarin334)两个剪接体,应用逆转录病毒载体建立稳定表达IRAS、IRAS1-826(短截突变体)、Nischarin472和Nischarin334基因的CHO细胞模型,并从与I1R配体结合特性、I1R激动剂对MAPK通路的激活及对细胞周期的影响三个方面深入探索剪接体的结构与功能。<br>　　研究结果:<br>　　1、对人IRAS和小鼠Nischarin同源蛋白进行搜索,筛选出其mRNA具有完整开放阅读框(有起始密码子及终止密码子)和具有polyA尾部部分或全部特征的同源蛋白,对其同源蛋白的氨基酸序列和mRNA序列分别与 IRAS/Nischarin蛋白序列和基因序列进行比对,结果表明人IRAS可能存在8个可变剪接体,其GenBank或Eensembl蛋白质序列ID号分别为 BAG63739.1、 CAB55920.1、 ENSP00000417812、 EAW65228.1、ENSP00000392484、BAG51306.1、ENSP00000410462、EAW65228.1。小鼠Nischarin可能存在6个,其GenBank蛋白质序列ID号分别是BAC37917.1、AAH03270.1、BAC25092.1、BAC39757.1、BAC29286.1、AAG42100.1。上述蛋白的mRNA序列与IRAS/Nischarin基因序列进行比对,结果表明,IRAS/Nischarin存在选择性起始、选择性终止、内含子保留、外显子跳跃等多种剪接方式;其可能存在的剪接位置主要在IRAS的第121aa、392aa、512aa、1152aa氨基酸残基处,此外可能还存在稀有剪接位置如246aa、472aa、657aa等氨基酸残基处;IRAS/Nischarin选择性起始剪接(多个异位启动)表明IRAS/Nischarin基因可能存在多个启动子。上述预测结果为I1R剪接体结构与功能的探索奠定了基础,提供了方向。<br>　　2、根据生物信息学预测结果,应用PCR法克隆了11个与预测剪接体有相似功能结构域的短截突变体,采用脂质体介导法将构建的重组载体转入真核细胞内。应用细胞免疫荧光法探索亚细胞定位结果表明,在转染 IRAS全长的细胞系上,IRAS亚细胞分布呈胞内囊泡状,这种分布特征需要PX结构域与SR或CC结构域共同作用。IRAS在细胞内以多聚体形式存在(同源或异源),提示 I1R在体内可能也以多聚体形式存在。在 IRAS的512aa～826aa氨基酸残基范围内存在核定位信号,提示某些I1R剪接体可能参与了基因转录调控。应用western-blot方法探索分子量特征,实验表明,SR及CC结构域对蛋白分子量影响很大,含有这两个功能结构域的短截突变体分子量比预测分子量大20KDa～50KDa,进一步佐证I1R在体内可能不是单体形式。<br>　　3、在结构与功能初步探索的基础上,成功克隆了Nischarin472和Nischarin334两个可变剪接体。结果表明,Nischarin472剪接方式是内含子保留,而Nischarin334是外显跳跃。其亚细胞定位均为胞内弥散分布,分子量与预测分子量基本一致。Nischarin472在大多数组织中均有表达,且外周组织器官表达高于脑内。<br>　　4、其后,通过逆转录病毒载体建立了稳定表达 IRAS、IRAS1-826、Nischarin472和Nischarin334基因的CHO细胞系。在细胞模型上, I1R激动剂能激活稳定表达 IRAS和IRAS1-826细胞系MAPK通路中的ERK磷酸化升高,且这种效应能被I1R拮抗剂依法克生抑制。在表达Nischarin472和Nischarin334细胞系中,I1R激动剂不能上调ERK磷酸化水平;稳定表达IRAS和IRAS1-826基因的CHO细胞系能与I1R配体([3H]-可乐定)特异结合,且其结合有饱和性和可逆性,而在稳定表达Nischarin472和Nischarin334的CHO细胞系上,未见其能与[3H]-可乐定的结合特性;细胞周期结果表明,稳定表达IRAS和IRAS1-826蛋白的CHO细胞系可能对细胞损伤具有一定的保护作用,但Nischarin472和Nischarin334不具备此功能,相反在细胞受到损伤时可能加速细胞损伤。<br>　　结论:<br>　　(1)IRAS亚细胞分布呈囊泡状,PX、SR或CC结构域共同作用决定此定位,LRR结构域与C末端(826aa～1504aa)未见其对亚细胞定位的影响,512aa～826aa范围内存在核定位信号,上述结果提示IRAS不同可变剪接体可能有不同的亚细胞定位;<br>　　(2)SR或CC结构域对IRAS蛋白分子量影响较大,提示IRAS可能通过这两个结构域与自身或剪接体相互作用而以多聚形式存在(其中可能还存在共价结合方式);<br>　　(3)IRAS的1aa～472aa和826aa～1504aa范围内的功能结构域单独存在时不具I1R样的功能,发挥I1R样功能的主要结构域存在512aa～826aa范围,但其功能的发挥可能是以多聚体形式存在;<br>　　(4)生物信息学分析结果表明,IRAS基因存在10个以上的可变接体,存在选择性起始剪接方式和选择性终止等多种剪接方式,提示IRAS基因可能存多个启动子。