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摘要本文主要分三部分进行了介绍：<br>　　第一部分 P53- saRNA对激素非依赖前列腺癌细胞 DU-145影响的试验研究<br>　　目的:探讨合成的P53 saRNA对 DU-145细胞 p53表达的影响及其对细胞凋亡、细胞周期的影响。<br>　　方法:根据文献报道设计并合成靶向 P53-285的小双链 RNA作为 P53 saRNA,同时合成一阴性对照系列作为控制RNA;利用脂质体法采用lipofectamineTM2000将 ds-RNA转染入前列腺癌细胞系 DU-145细胞中;转染72小时后收集细胞,采用RT-PCR检测 P53 mRNA,采用western-blot检测 p53蛋白的表达变化;同时采用AnnexinV-PI染色法和PI染色法,使用流式细胞仪分析其对它们凋亡和细胞周期的影响。<br>　　结果:P53 saRNA能使 DU-145细胞 P53 mRNA表达增加但 p53蛋白表达增加不明显; P53 saRNA对 DU-145细胞凋亡、细胞周期均无明显影响。<br>　　结论:P53-saRNA能激活变异型 p53 mRNA表达,但不能诱导其自身凋亡。说明 saRNA能否激活其靶基因的表达与靶基因变异有关,也从侧面说明变异型前列腺癌细胞 p53表达升高可能是其自身 micro-RNAs表达谱变化的结果。<br>　　第二部分 P53 saRNA载体的构建及鉴定<br>　　目的:探索 Si-RNA载体表达法原理是否适用于 Sa-RNA载体构建,并构建携带靶向 P53基因 Sa-RNA的真核表达载体。<br>　　方法:根据 P53-285序列及shRNA设计原则,设计并合成一对寡聚单链 DNA,克隆至 pENTR?/U6载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞 E.coliDH5a中,通过扩增后提取质粒 DNA测序分析;同时观察常见前列腺癌细胞系细胞转染该质粒72小时后其 P53表达变化。<br>　　结果:经 DNA测序证实成功构建带有 U6启动子的P53-sa-RNA真核表达载体;Du-145细胞转染72小时后,RT-PCR证实 P53表达上调。<br>　　结论:成功构建 pENTR/U6-P53- saRNA质粒,证明了载体表达法也适用于构建sa-RNA表达质粒。<br>　　第三部分 P53 saRNA联合 CP-31398对激素非依赖前列腺癌细胞 DU-145影响的试验研究<br>　　目的:探讨 P53-saRNA联合 CP-31398对 DU-145细胞 p53及其下游基因 p21表达的影响及其对细胞凋亡、细胞周期的影响。<br>　　方法:P53- saRNA转染 DU-145细胞后72小时,加入 CP-31398(浓度为2μg/ml)治疗24小时,收集细胞;采用MTT细胞活力试验测定细胞活力变化及抑制率;AnnexinV-PI染色法和PI染色法,使用流式细胞仪分析其对它们凋亡和细胞周期的影响;采用RT-PCR检测 P53基因下游基因 P21 mRNA表达变化。<br>　　结果:与单用P53- saRNA转染及单用CP-31398治疗相比,二者联合应用能明显抑制DU-145细胞活力,促进其凋亡,将细胞周期阻滞于 s期。经 RT-PCR证实其增加凋亡,阻滞细胞周期是通过激活 p53网络。<br>　　结论:P53- saRNA联合 CP-31398可用来诱导 DU-145细胞凋亡,也许可成为治疗激素非依赖性前列腺癌的工具。