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摘要第一部分：SPIO标记西藏小型猪骨髓间充质干细胞BMSCs的体外实验研究<br>　　目的:了解SPIO标记前后西藏小型猪骨髓间充质干细胞BMSCs的形态及超微结构变化，探讨该标记方法安全性、可行性，为体内示踪提供一定基础。<br>　　方法:1.取成年西藏小型猪骨髓，进行BMSCs分离、纯化和培养；观察其在光镜下的生长特征并记录其生长曲线；然后进行成脂、成骨诱导；最后进行其表面抗原（CD45、CD90和CD105）的鉴定，从而确定所获细胞绝大多数为BMSCs。<br>　　2.行普鲁士蓝染色观察不同浓度SPIO标记细胞内铁颗粒的情况，胎盘蓝排斥实验检测细胞活力，应用四唑盐(MTT)比色法观察标记前后细胞生长情况。<br>　　3.以浓度为25ug/ml的SPIO标记不同浓度细胞（1×107/ml、1×106/ml、1×105/ml、1×104/ml、1×103/ml）及空白对照，行MRI成像比较结果；应用不同浓度的（50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、琼脂糖）SPIO标记细胞量均为1×105/ml，行MRI成像比较结果。<br>　　4.透射电镜下观察不同浓度的SPIO标记BMSCs前后的形态结构的变化情况。<br>　　结果:1.骨髓干细胞悬液在接种后24h开始有细胞贴壁，48h完全换液后可见贴壁细胞分裂增殖，培养5～7d后细胞分裂增殖明显，出现形态均一的细胞增殖集落，形态逐渐变为长梭形，BMSCs在前12代可保持良好的生长状态；BMSCs可成功诱导出成骨细胞和脂肪细胞，茜素红和油红O可分别检测出钙结节和脂肪颗粒；BMSCs的表面标记物CD90阳性率为96.9％，CD105阳性率为95.7%，CD45阳性率为1.1%。<br>　　2. SPIO标记BMSCs标记率测定：不同浓度SPIO孵化过夜后，倒置显微镜下观察，可见各标记组细胞的胞浆内均有蓝色铁颗粒，标记率均接近100％；胎盘蓝拒染实验：不同浓度组的细胞活力与空白对照组相比未见明显差异；MTT结果显示：三种不同SPIO浓度下，标记24h内对BMSCs的生长、增殖无影响，浓度为50ug/ml时随着时间推移，对其生长、增殖有一定影响；<br>　　3.MRI扫描：SPIO标记浓度（25ug/ml）相同时，BMSCs细胞数量级分别为1×107/ml、1×106/ml、1×105/ml、1×104/ml、1×103/ml，可见随着密度减小，信号逐渐增强；细胞浓度（1×105/ml）相同时，铁浓度越大，信号变化越明显，MR所有序列中T2*WI信号变化最明显。<br>　　4.透射电镜观察显示标记的BMSCs细胞质中有高密度的铁粒子存在，这些铁粒子在细胞内以小囊泡状形式存在，其他结构未见明显差异。<br>　　结论:用该方法标记BMSCs简便、可行，并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有明显影响；MRI成像呈阴性改变，变化程度和细胞密度及SPIO的浓度在一定程度上呈正相关性；电镜下可观察到存在于小囊泡内高密度的铁粒子；该标记方法可应用于体内示踪实验。<br>　　第二部分：输注途径对SPIO标记的自体BMSCs在肾移植术后西藏小型猪体内分布影响的实验研究<br>　　目的:了解经移植肾动脉与髂总静脉两种途径输注SPIO标记的西藏小型猪自体BMSCs在肾移植受体体内的分布、存活及迁徙情况，探讨有效的输注途径。<br>　　方法:我们选择8-12月的西藏小型猪（重约15-20Kg），模拟人体器官移植的配型方法：选择其中ABO血型相同，交叉配血反应阴性，补体依赖细胞毒试验（CDC）又称微量淋巴细胞毒实验阴性（死亡细胞小于10%），单向混合淋巴细胞培养（MLR）反应性较低（受体淋巴细胞增值率≤0.60）的西藏小型猪共12头。采用“CTX+Pred”两联的诱导方案。采取一供二的形式，根据配型结果，选择当中与其配型相对较好的2头为受体。供肾采用整块切取的方法，随机供给其相对应受体，植肾于侧腹膜后。实验分为经移植肾动脉输注组和经髂总静脉输注组，每组4例。经移植肾动脉输注组：在术中开放血流后经移植肾动脉输注浓度为25ug/ml的SPIO标记的自体BMSCs（约2×106/kg）；经髂总静脉输注组：在术中开放血流后经髂总静脉输注浓度为25ug/ml的SPIO标记的自体BMSCs（约2×106/kg）。两组均在术后24h处死受体猪，分别取移植肾、原肾、肺脏、心、肝、脾、胰等脏器，然后分别行普鲁士蓝染色、H-E染色及透射电镜观察。<br>　　结果:上述模拟人体器官移植的配型方法建立的肾移植模型除一头经髂外静脉输注死于麻醉意外，其余均获成功。术后普鲁士蓝染色病理切片显示：经移植肾动脉输注组SPIO标记的自体BMSCs主要分布在移植肾和肺脏，在其他脏器未发现明显的阳性细胞；髂总静脉输注组经过上述方法观察显示主要分布于肺脏，少量在移植肾，其他器官只在肝脏和心脏找到1-2个可疑阳性细胞。透射电镜仅在肾动脉输注组的移植肾有发现，其他均未发现。<br>　　结论:经移植肾动脉输注自体BMSCs途径比经髂总静脉输注途径更有利于西藏小型猪自体BMSCs在移植肾内的定植、分化，可以有效减少肺脏及其他脏器的“俘获”作用。