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摘要目的:<br>　　1、筛选Bmi-1基因的RNAi表达的siRNA序列；<br>　　2、观察RNA干扰（RNAi）技术沉默Bmi-1基因后对Bmi-1及其下游基因P16INK4a表达的影响；<br>　　3、观察RNA干扰（RNAi）技术沉默Bmi-1基因后对人大肠癌细胞株LOVO增殖和侵袭力的影响。<br>　　方法：<br>　　1、用荧光标记的FAM-siRNA转染细胞并观察转染效率，按照lipofectamine2000说明书设置不同浓度梯度的FAM-siRNA Oligo以及lipofectamine2000的用量，将其转染至24孔板细胞中。6小时后在荧光显微镜下观察转染效率，以明确优化转染后的最佳条件。<br>　　2、筛选出沉默效应最强的的Bmi-1 siRNA序列。实验随机分为4组：siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组（阴性对照组）。次日，分别利用lipofectamine2000转染至6孔板细胞中，转染48h后提取细胞RNA。Real-time PCR检测细胞Bmi-1的mRNA表达水平，以筛选出沉默效应最强的的Bmi-1 siRNA序列以及检测Bmi-1 siRNA对细胞中Bmi-1 mRNA表达水平的影响。<br>　　3、Western Blot（蛋白质印记法)检测Bmi-1及其下游基因P16INK4a蛋白表达水平。实验随机分为3组：Bmi-1siRNA组（转染筛选出的特异siRNA1），阴性对照组（转染无特异靶基因的siRNA）、空白对照组（未转染任何 siRNA序列）。次日，分别利用lipofectamine2000转染至6孔板细胞中，培养60h后提取细胞蛋白。Western Blot检测Bmi-1及其下游基因P16INK4a蛋白表达水平。<br>　　4、MTT比色法检测大肠癌细胞增殖的变化。细胞随机分为3组：Bmi-1siRNA组（转染筛选出的特异siRNA1），阴性对照组（转染无特异靶基因的siRNA）、空白对照组（未转染任何siRNA序列）。次日，分别利用lipofectamine2000转染至96孔板细胞中。于37℃，5％CO2培养箱中培养12hs、24hs、48hs、60hs，分别在上述时段用酶标仪在550nm波长处分别检测Bmi-1siRNA组、阴性对照组、空白对照组的OD值，绘制其生长曲线。<br>　　5、Transwell小室侵袭实验检测大肠癌细胞侵袭力的变化。预先制备无基质胶的Transwell小室,细胞随机分为3组：Bmi-1siRNA组（转染筛选出的siRNA1序列），阴性对照组（转染无特异靶基因的siRNA）、空白对照组（未转染任何siRNA序列）。次日，分别利用lipofectamine2000转染至6孔板细胞中。培养48h后用0.25%的胰酶消化细胞，以5×105个/ml细胞密度接种于预先制备的Transwell小室上室中，培养48h后取出Transwell小室，进行染色以及显微镜下细胞计数。<br>　　结果：<br>　　1、荧光标记观察转染效率：在倒置荧光显微镜下观察细胞，同一视野下，发微弱到明亮绿色荧光的细胞均被认为是转染成功，获得转染效率达70%左右。说明Lipofectamine2000介导的化学合成的siRNA有较高的转染效率。<br>　　2、mRNA相对表达量以2-ΔΔCt计算，统计结果显示。Bmi-1 mRNA在siRNA1组的相对表达量明显低于其他组，其表达抑制率为75%(P<0.05)，而在siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组(阴性对照组)的mRNA表达无明显差异(P<0.05)，说明siRNA1能够抑制 Bmi-1在 mRNA水平的表达。<br>　　3、Western blot结果示：Bmi-1/β-actine蛋白在Bmi-1siRNA组、阴性对照组、空白对照组的灰度比值分别为：0.532±0.066、1.152±0.038、1.137±0.042，显示 Bmi-1蛋白表达在 Bmi-1siRNA组明显低于其他组(P<0.05)，而在阴性对照组、空白对照组的蛋白表达无明显差异(P>0.05)。P16INK4a/β-actine蛋白在 Bmi-1siRNA组、阴性对照组、空白对照组的灰度比值分别为：2.186±0.137、1.772±0.088、1.717±0.099，显示P16INK4a蛋白表达在Bmi-1siRNA组的表达高于其他组（p<0.05），而在阴性对照组、空白对照组的蛋白表达无明显差异(P>0.05)。<br>　　4、LOVO细胞经Bmi-1 siRNA转染后，在12hs,24hs,48hs,60hs时检测 Bmi-1 siRNA组的OD值分别是0.20±0.019(12hs),0.37±0.036(24hs),0.48±0.027(48hs) and0.67±0.051(60hs)，明显低于阴性对照组、空白对照组。从第二天（24hs）开始，Bmi-1siRNA组细胞生长速度明显慢于阴性对照组和空白对照组，Bmi-1siRNA组的细胞增殖力与阴性对照组和空白对照组比较，有显著差异(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组细胞增殖力无明显统计学差异(P>0.05)，说明转染了Bmi-1 siRNA的细胞在 Bmi-1表达受抑制后细胞，细胞生长受到抑制，其增殖力明显减弱，表明针对Bmi-1基因的特异性的RNAi能显著抑制大肠癌LOVO细胞的生长。<br>　　5、LOVO细胞经 Bmi-1 siRNA转染后穿过 Martrigel滤膜细胞数为（181.330±8.140）明显少于阴性对照组(307.000±12.120)，有显著统计学差异（P<0.05）。由此表明转染针对Bmi-1 siRNA能显著减弱大肠癌LOVO细胞侵袭力。<br>　　结论：<br>　　1.化学合成的靶向Bmi-1 siRNA转染人大肠癌LOVO细胞能有效抑制Bmi-1mRNA和蛋白表达水平及上调其下游基因P16INK4a蛋白表达水平；<br>　　2.针对Bmi-1基因的RNA干扰通过上调P16INK4a蛋白表达有效抑制人大肠癌LOVO细胞的增殖和侵袭力。