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摘要糖尿病是以高血糖为特征的慢性代谢性疾病,近几年来其发病率一直呈上升和低龄化趋势,研究表明糖尿病易引起心、血管、眼、神经肌肉、肾脏、皮肤等并发症的发生,严重危害人体健康,糖尿病并发症是导致糖尿病患者致残和致死的主要原因。临床上常见糖尿病患者皮肤菲薄、易破损及创面难愈导致远端肢体溃疡,而且糖尿病皮肤并发症最常见的表现为皮肤干燥、瘙痒,严重影响患者的生活质量,具体产生的作用机制目前还不清楚。我们前期研究发现糖尿病小鼠皮肤变薄,皮肤胶原蛋白含量减少,真皮层胶原纤维结构疏松、紊乱。为什么糖尿病会引起皮肤胶原蛋白含量减少?具体作用机制是什么?本文旨在从细胞分子水平探讨不同浓度高糖和糖基化终产物对皮肤成纤维细胞的影响,研究皮肤胶原蛋白合成减少的原因并初步探讨其作用机制,为今后临床上防治糖尿病皮肤并发症的发生和药物研发提供实验数据和理论依据。<br>　　一、高糖对大鼠皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响<br>　　目的:研究不同浓度葡萄糖对体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞的损伤作用,以及对胶原蛋白合成的影响,探讨糖尿病皮肤变薄的机理。<br>　　方法:取新生乳鼠皮肤进行真皮成纤维细胞的原代和传代培养。实验分四组:正常对照组(25mmol/L)、高糖1组(30mmol/L)、高糖2组(35mmol/L)、高糖3组(40mmol/L),分别培养24h、36h,倒置相差显微镜观察细胞形态结构;MTT法测定细胞存活率;生化法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量;用试剂盒法(消化法)检测细胞培养液中羟脯氨酸含量的变化;用RT-PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达以及基质金属蛋白酶(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制酶(TIMP-2)mRNA水平的表达情况。<br>　　结果:高糖(30、35、40mmol/L)对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用。高浓度葡萄糖对大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤比较明显,细胞中SOD和GSH含量显著低于对照组,而MDA含量明显高于对照组(P＜0.05和P＜0.001)。细胞培养液中羟脯氨酸的含量与对照组比较差异显著(P＜0.001),并随葡萄糖浓度的增高羟脯氨酸含量降低越明显。RT-PCR结果显示,高糖培养的皮肤成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白的表达水平明显下调,MMP-2 mRNA水平明显上升,TIMP-2则明显下降,与对照组比较差异显著(p＜0.05)。<br>　　结论:高浓度葡萄糖对大鼠皮肤成纤维细胞具有明显的氧化损伤作用,并能减少胶原蛋白分泌,其作用机制是通过下调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和TIMP-2 mRNA的表达或上调MMP-2 mRNA的表达从而降低胶原蛋白的合成。<br>　　二、糖基化终末产物对大鼠皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响<br>　　目的:研究不同浓度AGEs对大鼠皮肤成纤维细胞的损伤,以及对胶原蛋白合成的影响,初步探讨不同浓度AGEs与糖尿病皮肤病变之间的关系。<br>　　方法:将100mmol/L葡萄糖与50g/L牛血清白蛋白(BSA)在37℃条件下孵育3个月后制备糖基化终产物。以体外培养的皮肤成纤维细胞为实验对象加入AGEs作为损伤剂,分别培养24h、36h。实验分为4组:正常对照组(0mg/mL);AGEs 1组(0.5mg/mL);AGEs 2组(1mg/mL);AGEs 3组(2mg/mL);用MTT法测定细胞存活率;生化法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。试剂盒法(消化法)检测细胞培养液中羟脯氨酸分泌情况;RT-PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达以及MMP-2和TIMP-2 mRNA表达情况。<br>　　结果:AGEs以剂量依赖方式抑制成纤维细胞的增殖(P＜0.001)。AGEs 1组、AGEs 2组以及AGEs 3组细胞内MDA含量显著高于正常对照组(P＜0.05和P＜0.001),但SOD和GSH含量却明显下降(P＜0.05和P＜0.001)。细胞培养液中羟脯氨酸含量明显降低,并且作用时间越长,抑制作用越明显(P＜0.05和P＜0.001)。RT-PCR结果显示,AGEs可下调皮肤成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白的表达水平,MMP-2mRNA水平较对照组明显上升,TIMP-2则明显下降,与对照组比较差异显著(p＜0.05,P＜0.001)。<br>　　结论:AGEs呈浓度依赖性地抑制皮肤成纤维细胞增殖,糖尿病状态下AGEs蓄积是导致大鼠皮肤成纤维细胞功能异常的重要原因,可能也是导致糖尿病患者皮肤病变的重要原因和皮肤胶原蛋白减少以及胶原蛋白紊乱的重要原因之一。<br>　　综合上述实验结果可得出如下结论:(一)高糖和AGEs对皮肤成纤维细胞有明显损伤作用,能影响细胞增殖,并呈明显的剂量关系,其可能是通过氧化应激(OS)途径、晚期糖基化终末产物(AGEs)途径等来影响成纤维细胞的正常生理功能的,而且AGEs比高浓度葡萄糖对成纤维细胞的损伤作用更明显。(二)高糖和AGEs均能影响皮肤成纤维细胞胶原蛋白的合成,机制可能是通过直接抑制成纤维细胞中Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白和TIMP-2 mRNA水平的表达和提高MMP-2 mRNA的表达,从而抑制皮肤成纤维细胞胶原蛋白的分泌,这可能是糖尿病皮肤变薄、皮肤胶原纤维紊乱的主要原因之一,也可能是导致糖尿病皮肤病变发生重要因素之一。