检索历史 清除

摘要脑胶质瘤是颅内最常见的原发恶性肿瘤，具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低的特点，目前对其病因、发病机制及生物学特性的深入探讨以及寻找新的治疗策略，是亟待解决的热点和难题。基因治疗能针对肿瘤组织中特有的基因变异进行修复或促使肿瘤细胞凋亡，具有广阔的应用前景。由于脑内的神经元和大部分其它细胞为静止期细胞，分裂活跃的细胞主要为肿瘤细胞，因此，恶性脑胶质瘤的基因治疗的靶目标性强。核仁素（NCL）是真核细胞核仁中一种多功能磷酸蛋白，其表达水平与细胞分裂的速率呈正相关，常被用来作为肿瘤细胞增殖程度的一种非特异性指标。<br>　　目的：通过RNA干扰核仁素和应用JNK抑制剂SP600125，观察对U251细胞增殖和凋亡的影响，探讨其可能机制，为神经胶质瘤的临床治疗新途径的研究提供实验基础和科学的理论依据。<br>　　方法：<br>　　(1)采用浓度为10,20,30,40,50μM的JNK抑制剂SP600125分别处理人脑胶质瘤细胞株U251细胞0h,24h,48h和72h，利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖水平，取合适值作为实验浓度进行Western blot和Immunocytochemistry检测P-c-jun和核仁素蛋白表达水平。<br>　　(2)将核仁素干扰质粒：NCL-234，NCL-1509，NCL-1732，NCL-1825和阴性对照质粒转入U251细胞，然后采用real-time PCR和Western blot方法分别检测核仁素的mRNA和蛋白水平表达情况，筛选出有效干扰质粒。<br>　　(3)将实验分为转染阴性质粒对照组、RNA干扰核仁素组、转染阴性质粒联合JNK抑制剂处理组和干扰联合JNK抑制剂组，进行Western blot检测相关凋亡蛋白Bcl-2，bax的表达变化。<br>　　结果：<br>　　(1)MTT结果显示，不同浓度SP600125分别处理细胞24,48,72h后，处理组U251细胞与对照组相比，培养24h时各组之间细胞的增殖没有明显变化，48h之后当浓度大于40μM时SP600125对细胞的抑制作用明显增强，随着SP600125浓度增加和作用时间延长，细胞增殖抑制越明显，其抑制作用呈现剂量依赖性和时间依赖性；Western blot检测显示P-c-jun和核仁素蛋白表达呈相同下调趋势；免疫荧光检测核仁素发生明显的从胞核向胞浆的移位，Hoechst33242染核后荧光显微镜观察表明，JNK抑制剂处理48h之后，部分细胞核出现明显的凋亡特征，如核体积变小、固缩，部分细胞核裂解为碎块，呈致密浓染的颗粒状荧光。<br>　　(2)荧光显微镜观察，质粒成功转入U251细胞；real-time PCR、Western blot结果显示，干扰质粒能不同程度下调NCL mRNA水平及其蛋白表达，其中干扰质粒NCL-234作用效果最为显著。<br>　　(3)结果显示，RNA干扰核仁素组，转染阴性质粒联合JNK抑制剂处理组，干扰联合JNK抑制剂处理组与转染阴性质粒组相比，细胞凋亡明显，Bcl-2表达不同程度减少，Bax表达则相应增高。<br>　　结论：<br>　　(1)JNK抑制剂能够抑制U251细胞活性并促进其凋亡，JNK和核仁素共同参与U251细胞增殖抑制和凋亡过程。<br>　　(2)NCL mRNA干扰能明显促进U251细胞凋亡，抑制JNK信号通路的激活可以显著降低U251细胞的增殖水平。提示核仁素下调是诱导U251细胞增殖抑制和凋亡的重要原因，SP600125通过特异性抑制JNK活性减少核仁素的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，从而发挥抗肿瘤效应。