硫化氢在肾脏纤维化中的作用及其机制研究-论文-万方医学网

硫化氢在肾脏纤维化中的作用及其机制研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要第一部分单侧输尿管梗阻大鼠硫化氢合成酶表达及血浆硫化氢浓度变化 　　目的：观察经典肾脏纤维化模型—单侧输尿管梗阻大鼠模型（unilateral uretheral obstruction，UUO）肾脏组织中硫化氢合成酶—胱硫醚-β-合成酶（cystathionineb-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）的蛋白表达及血浆H2S浓度的变化。 　　方法：SD大鼠分成假手术组（sham组）和左侧输尿管梗阻组（UUO组）。造模两周后处死动物，使用HE染色评价两组大鼠肾脏小管间质损伤程度，Masson染色评价肾间质胶原纤维面积，western blot测定肾皮质CBS和CSE的蛋白表达。使用硫化氢荧光探针（DNZ-As）测定两组大鼠血浆硫化氢浓度。 　　结果：与正常大鼠对比，UUO模型大鼠造模两周后肾皮质CBS表达明显下降，而CSE代偿性升高，血浆H2S较正常大鼠下降。 　　结论：UUO损伤导致了肾脏硫化氢合成关键酶CBS表达下降，CSE代偿性升高，血浆H2S浓度下降，表明H2S参与了UUO诱导的肾脏纤维化的病理过程。 　　第二部分外源性硫化氢对UUO大鼠肾脏纤维化的干预作用 　　目的：探讨外源性硫化氢治疗UUO的疗效和安全剂量范围。 　　方法：应用不同浓度H2S供体（NaHS）、依那普利、CBS抑制剂（aminooxyacetate，AOAA）和CSE抑制剂（propargylglycine，PAG）干预 UUO大鼠，通过大体外观、病理染色、免疫组化和蛋白印迹等方法评价药物干预对肾间质纤维化的影响。实验分组：假手术组（sham）、UUO组、UUO+10mg/kg/d依那普利组、UUO+5.6mg/kg/d NaHS组、UUO+56mg/kg/d组、UUO+560mg/kg/d组、UUO+5mg/kg/d AOAA组、UUO+25mg/kg/d PAG组。所有干预在术前三天给药，NaHS、AOAA和PAG为腹腔注射，依那普利为灌胃，给药持续至术后14天。 　　结果：与UUO组比较，依那普利、5.6mg/kg/d NaHS和56mg/kg/d NaHS改善了肾间质纤维化（P<0.05），表现为肾脏体积缩小，肾皮质厚度增加。HE染色肾间质小管损伤评分下降，Masson染色肾间质胶原纤维沉积减少，肾皮质Fibronectin(FN)和a-SMA表达下调。56mg/kg/d NaHS抗纤维化效果与依那普利相当，且优于5.6mg/kg/d NaHS。560mg/kg/d NaHS、AOAA和PAG未能表现出抗纤维化作用。 　　结论：剂量NaHS能够减轻UUO大鼠模型的肾脏间质纤维化。该效应起于5.6mg/kg/d，达峰于56mg/kg/d，翻转于560mg/kg/d。 　　第三部分硫化氢对肾间质成纤维细胞活化相关蛋白表达的影响 　　目的：观察硫化氢能否减轻肾间质成纤维细胞（NRK49F）的增殖和分化。 　　方法： 　　（1）培养肾间质成纤维细胞，同步化后细胞分成对照组、NaHS组、TGF-b1组和NaHS联合TGF-b1组，分别处理12小时和24小时后，使用RT-PCR及Western blot测定各组细胞纤维化相关蛋白的mRNA及蛋白表达。 　　（2）同步化后细胞分成对照组、NaHS组、10%FBS组和NaHS联合10%FBS组，培养24小时后使用MTT法、Brdu染色和western blot观察NaHS对细胞数目、DNA合成以及增殖相关蛋白表达的的影响。 　　结果：表明2ng/ml TGF-b1刺激细胞12h后细胞内collagen-I、FN和a-SMA mRNA表达上调，24小时后FN和a-SMA蛋白表达上调（P<0.05）。NaHS(100mmol/L)预处理0.5h后collagen-I、FN和a-SMA mRNA表达和FN和a-SMA蛋白表达较2ng/ml TGF-b1单独刺激组明显下降（P<0.05）。MTT法表明与10%FBS单独刺激细胞增殖24小时后细胞数目明显增多，NaHS(10～100μM)预处理0.5h后降低了FBS所致的细胞数目增多（P<0.05），上述抗增殖效应在NaHS100μM最为明显。BrdU渗入法表明10%FBS刺激细胞增殖5h后，细胞核内DNA渗入明显增加。与FBS组相比，NaHS100μM预处理0.5h降低了细胞核内的DNA渗入。进一步研究表明10%FBS刺激细胞增殖24小时后细胞内PCNA和C-myc等增殖相关蛋白表达上调。与FBS组相比，NaHS100μM预处理0.5h降低了PCNA和C-myc的蛋白表达（P<0.05）。 　　结论：NaHS能够通过抑制肾间质成纤维细胞的分化和增殖而发挥抗纤维化作用。 　　第四部分硫化氢减轻肾脏纤维化的机制研究 　　目的：探讨NaHS抑制肾间质成纤维细胞活化的机制。 　　方法： 　　（1）应用2ng/ml TGF-b1刺激NRK-49F不同时间（0.5-2h）。通过western blot方法检测TGF-b1信号通路中Smad3和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK）信号通路中ERK、P38和JNK磷酸化。然后在此时间基础上，加用NaHS100μM预处理0.5h，观察信号转导因子及相关蛋白磷酸化水平的变化。 　　（2）使用二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）测定细胞内活性氧（ROS）的水平，评价NaHS能否抑制TGF-b1导致的NRK49F细胞ROS的产生。 　　（3）肾脏皮质CD68染色评价NaHS能否抑制肾间质巨噬细胞浸润。 　　结果： 　　（1）2ng/ml TGF-b1刺激细胞后，P38磷酸化于0.5h达高峰，Smad3为1小时，ERK和JNK为2小时，此后下降。选择2ng/ml TGF-b1刺激细胞1小时为时间点，NaHS100μM预处理0.5h，与TGF-b1单独刺激组相比，细胞内Smad3、ERK、P38和JNK蛋白磷酸化水平下降（P<0.05）。 　　（2）NaHS抑制了TGF-b1刺激的细胞内ROS的荧光强度。 　　（3）与UUO组比较，依那普利、5.6mg/kg/d NaHS和56mg/kg/d NaHS减少了肾脏皮质CD68阳性染色的细胞数目。 　　结论：NaHS能够通过通过抑制肾内炎症和ROS的产生，以及抑制TGF-b1和MAPK两条致纤维化信号通路抑制肾间质成纤维细胞的活化。 　　综上所述，H2S能够减轻UUO大鼠的肾脏纤维化，其剂量效应关系表现为“钟形”曲线。离体实验进一步证实H2S能够抑制肾脏成纤维细胞的分化和增殖。H2S抗纤维化的机制与抑制了TGF-b1和MAP激酶信号转导通路有关。本研究提示小剂量H2S有望用于肾脏纤维化的治疗。