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摘要研究背景和目的:<br>　　诸多恶性肿瘤,如肺癌,乳腺癌,前列腺癌,甲状腺癌等,于疾病晚期常常发生肿瘤骨转移,并多表现为溶骨性骨破坏从而引发众多种严重并发症,如骨质疏松、进行性顽固性骨痛、病理性骨折、脊髓压迫综合征、高钙血症等,这些并发症在生理和心理上严重影响患者生活质量,降低了5年幸存率。因此,对于如何能更好的预防和治疗转移性骨肿瘤疾病成为亟待解决的重要问题之一。<br>　　肿瘤骨转移发生时基于脱落的具有干细胞特性的肿瘤细胞经过包括浸润、转移在内的一些复杂、有序的过程,而后定植于正常的骨组织,随后它在此特定的骨微环境中分泌一系列细胞因子、生长因子等,包括甲状旁腺相关蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein,PTHrP)、白细胞介素-1/6/8/11(interleukin,IL-1/6/8/11)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等,进而破坏正常的成骨细胞(Osteoblasts,OBs)和破骨细胞(Osteoclasts,OCs)间的动态的生理平衡,使得宿主OCs过度活化、成熟,而OBs的生长则受到抑制,从而引起严重的溶骨性反应。接下来,骨组织的溶解使得大量生长因子,如胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等释放至骨微环境中,被肿瘤细胞加以利用,从而促进自身的进一步定植与增殖。如果可以打破这种相互作用将会使得我们更加深入认识转移性骨肿瘤疾病并且有望设计出一种特异性的治疗方法。<br>　　血小板衍生生长因子-D(platelet-derived growth factor D,PDGF-D)为PDGF家族新成员,它可以调节包括细胞的增殖、凋亡、变形、迁移、侵袭以及血管生成等在内的多个细胞内进程。其通过与PDGF的酪氨酸激酶受体(即PDGFR-β)结合,进而发挥细胞生物学影响。磷酸化后的PDGF受体可引起一系列下游信号途径的级联反应,包括PI3K、Akt、NF-κB、Notch、ERK等等。PDGF-D广泛高表达于多种恶性肿瘤,例如前列腺癌、肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、脑肿瘤、和胰腺癌中,比起PDGF-B,它被认为是更好的侵袭性的分子标志。在单独作用于PDGFR-β后,PDGF-D促进了肿瘤的侵犯过程,增加MMPs的表达,甚至促进肿瘤上皮-间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生。研究发现,在肿瘤癌骨转移中,尤其是前列腺,PDGFR-β起到了关键的作用:免疫组化分析显示,在大多数前列腺癌肿瘤组织中,包括前列腺癌骨转移灶和原发灶中,PDGFR-β都有显著表达,其基因被作为五个预示复发的标志基因之一。同时,PDGF-D的表达升高与前列腺癌的Gleason评分以及肿瘤分级密切相关。最近,在联合免疫缺陷小鼠皮下接种前列腺癌细胞的一项研究结果显示,PDGF-D/PDGFR-β信号系统的激活可以促进皮下肿瘤的形成,强化了癌细胞侵犯周围基质的能力。因此,本课题组推测,在肿瘤转移至骨的最初阶段以及此后的恶性循环过程中,PDGF-D/PDGFR-β信号可能参与了溶骨性破坏的过程,其参与方式有可能是通过对OCs的活化而实现的。<br>　　因此,本课题研究拟通过检测PDGF-D在人乳腺癌细胞系中的表达及其受体在人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的表达,探究PDGF-D对OCs活化的可能性;而后通过引入外源性的PDGF-D因子作用于PBMCs,观察其对OCs活化过程的作用并尝试评价其对该过程的影响。从而加深对PDGF-D以及OCs活化、成熟过程的认识,为进一步深入研究其具体的作用信号路径与机制等相关研究做好实验参考与理论依据。<br>　　方法:<br>　　第一部分分题一:<br>　　1、免疫荧光检测PDGF-D在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中的表达。<br>　　2、Real-timePCR检测MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中PDGF-DmRNA的表达。<br>　　3、ELISA检测MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞上清液中PDGF-D蛋白分泌量的情况。<br>　　第一部分分题二:<br>　　1、Ficoll法分离获得PBMCs,并用贴壁培养法纯化细胞。<br>　　2、免疫荧光检测PDGF-D在PBMCs和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的表达。<br>　　3、Real-time荧光定量PCR检测PDGF-DmRNA在PBMCs和MDA-MB-231细胞的表达。<br>　　4、ELISA检测PBMCs和系MDA-MB-231细胞培养基中PDGF-D蛋白的表达。<br>　　5、RT-PCR半定量检测PBMCs中PDGFR-α和PDGFR-βmRNA的表达。<br>　　6、WesternBlot检测PBMCs中PDGFR-α蛋白和PDGFR-β蛋白的表达。<br>　　第二部分分题一:<br>　　1、获得PBMCs后,实验分为三组:a、阳性对照组(PCG):RANKL+M-CSF+PBMCs;b、阴性对照组(NCG):α-MEM培养基+PBMCs;c、实验组(EG):PDGF-D+PBMCs。<br>　　2、倒置相差显微镜下观察以上三组细胞。<br>　　3、TRAP染色观察三组细胞中的细胞形态。<br>　　4、骨吸收实验检测三组细胞中细胞的骨吸收能力。<br>　　5、Real-timePCR检测三组细胞TRAP、CK、MMP-9mRNA的表达。<br>　　6、ELISA检测第15d三组细胞上清液中MMP-9蛋的表达。<br>　　7、Westernblot检测三组细胞CK蛋白表达。<br>　　第二部分分题二:<br>　　1、获得PBMCs后,实验分三组:a、阻断组(BG):PBMCs+M-CSF+PDGF-D+PDGF-DAb;b、对照组(CG):PBMCs+α-MEM培养基;c、诱导组(IG):PBMCs+PDGF-D。<br>　　2、倒置相差显微镜下观察以上三组细胞。<br>　　3、TRAP染色观察三组中各细胞形态。<br>　　4、骨吸收实验检测三组细胞中细胞的骨吸收能力。<br>　　5、Real-timePCR检测三组细胞TRAP、CK、MMP-9mRNA的表达。<br>　　6、ELISA检测三组细胞MMP-9蛋白的表达。<br>　　7、Westernblot检测三组细胞CK蛋白表达。<br>　　8、以上所有数据采用SPSS17.0统计软件分析。<br>　　结果:<br>　　第一部分分题一:<br>　　1、免疫荧光显示:PDGF-D在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的胞浆中表达,并且PDGF-D在MDA-MB-231中的表达显著高于其在MCF-7中的表达(p<0.05)。<br>　　2、PDGF-DmRNA在MDA-MB-231细胞中的表达显著高于其在MCF-7细胞中的表达(p<0.05)。<br>　　3、ELISA法检测PDGF-D蛋白的表达,获标准曲线直线回归方程[(Y=0.899X+0.114,R2=0.9994)],PDGF-D在MDA-MB-231细胞24h和48h两时间点均显著高于MCF-7的表达(p<0.05)。<br>　　第一部分分题二:<br>　　1、通过Ficoll法获得PBMCs,纯度及数量均能够满足实验需要。<br>　　2、免疫荧光显示:PDGF-D在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的胞浆中有明显表达,而在PBMCs中则未见其表达,仅见蓝染细胞核。<br>　　3、Real-Time荧光定量PCR检测显示:PDGF-DmRNA在MDA-MB-231细胞中有较高表达,而在PBMCs中则未见表达(p<0.05)。<br>　　4、ELISA法检测PDGF-D蛋白的表达,获标准曲线直线回归方程[(Y=0.993X+0.139,R2=0.9991)],PDGF-D在MDA-MB-231细胞在24h和48h两时间点的表达均显著高于PBMCs相应时间点的表达(p<0.05)。同时,PDGF-D在PBMCs的表达,在24h和48h无统计学差别(p>0.05),且均显著低于其在MDA-MB-231中的表达(p<0.05)。<br>　　5、RT-PCR半定量检测显示:PBMCs中PDGFR-α和PDGFR-βmRNA均有表达,通过ImageJ软件分析灰度值并进行统计分析显示,PDGFR-βmRNA的表达量高于PDGFR-αmRNA(p<0.05)。<br>　　6、Western blot检测PBMCs中PDGFR-β蛋白的表达显著高于PDGFR-α蛋白的表达(p<0.05)。<br>　　第二部分分题一:<br>　　1、PCG和EG可见破骨样细胞(Osteoclast like cells,OLCs),而NCG细胞胞体小,且为单核。<br>　　2、TRAP染色:PCG和EG内可见大量TRAP阳性细胞,而NCG则未见。<br>　　3、骨吸收实验:PCG和EG的骨片上均有蓝色或紫色深染的骨吸收陷窝,而NCG则未见。<br>　　4、NCG的TRAP、CK、MMP-9mRNA的表达均显著低于PCG和EG(p<0.05),而其在BG和CG中的表达无显著差异(p>0.05)。<br>　　5、ELISA法检测MMP-9蛋白:PCG和EG的表达显著高于NCG(p<0.05),且PCG和EG之间无显著差异(p>0.05)。<br>　　6、Western blot检测CK蛋白的表达:PCG和EG均显著高于NCG(p<0.05),而两组间无显著差异(p>0.05)。<br>　　第二部分分题二:<br>　　1、IG可见典型OLCs,而BG和CG则未见。<br>　　2、TRAP染色:IG内可见大量TRAP阳性细胞,而BG和CG未见。<br>　　3、骨吸收实验:IG骨片上可见骨吸收陷窝,而BG和CG均未见。<br>　　4、Real-timePCR:对BG和CG的TRAP、CK、MMP-9mRNA的表达均显著低于IG(p<0.05),同时其在BG和CG的表达无显著差异(p>0.05)。<br>　　5、ELISA法检测MMP-9蛋白:BG和CG显著低于IG(p<0.05),且前两组之间无显著差异(p>0.05)。<br>　　6、Western blot检测CK蛋白表达:BG和CG表达量均显著低于IG(p<0.05),且前两组间无显著差异(p>0.05)。<br>　　结论:<br>　　1、PDGF-D在不同转移潜能的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中均有表达。<br>　　2、PDGF-D在PBMCs中未检测到表达。<br>　　3、在PBMCs中,PDGF-D的特异性受体PDGFR-β的表达显著高于PDGFR-α的表达。<br>　　4、外源性PDGF-D可在无RANKL+M-CSF的条件下独立诱导PBMCs分化为破骨样细胞。<br>　　5、外源性PDGF-D抗体可阻止PDGF-D与其特异性受体PDGFR-β的结合,从而阻断PBMCs向破骨样细胞分化过程。