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摘要目的:脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征(acuterespirarorydistresssyndrome,ARDS)为临床常见危重症,肺泡上皮细胞损伤是其主要病理改变之一。研究显示维生素D除具有经典的调节钙磷平衡作用外,还具有免疫调节和抗肿瘤等广泛的骨外生物学效应。目前有关维生素D在组织结构细胞,特别是脓毒症时肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolarepithelialcelltypeⅡ,ATⅡ)中干预作用的研究相对少见。本研究选取人ATⅡ细胞系A549为研究对象,以脂多糖为刺激因素,探究维生素D对ATⅡ炎症反应的干预作用及相关机制,为临床防治脓毒症型ARDS提供理论依据。<br>　　方法:<br>　　1.以体外培养的A549细胞为研究对象,首先,按照对照组、LPS刺激组(1μg/ml)、LPS+25(OH)D3(100nmol/L)干预组、LPS+1α,25(OH)2D3(100nmol/L)干预组、25(OH)D3(100nmol/L)干预组、1α,25(OH)2D3(100nmol/L)干预组分组;再次,按照1α,25(OH)2D3(100nmol/L)的不同干预时间点(LPS刺激前24小时、LPS刺激前16小时、LPS刺激前6小时、LPS刺激前3小时、同时给药、LPS刺激后3小时、LPS刺激后6小时)分组;最后,按照1α,25(OH)2D3的不同给药浓度(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)分组;以LPS的给药时间为起点,24小时后收集细胞培养上清。另外,给予1α,25(OH)2D3(1μmol/L)干预,分别于LPS刺激6小时、12小时后收集细胞培养上清。通过酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测细胞培养上清中炎症因子白介素(interleukin,IL)-8的表达水平。<br>　　2.按照对照组、LPS刺激组(1μg/ml)、LPS+1α,25(OH)2D3(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)干预组分组;于LPS刺激A549细胞24小时后应用MTT法检测细胞增殖活力。<br>　　3.应用免疫组化、免疫荧光方法检测人正常肺组织中ATⅡ及A549细胞维生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)、1α-羟化酶(CYP27B1)的表达分布。<br>　　4.按照对照组、LPS刺激组、LPS+1α,25(OH)2D3(1μmol/L)干预组、1α,25(OH)2D3(1μmol/L)干预组分组,在LPS刺激30分钟和24小时后收集细胞提取总蛋白,应用WesternBlot方法检测NF-κBp65、IκB-α蛋白的表达水平;应用免疫荧光方法检测NF-κBp65的表达及核转位。<br>　　结果:<br>　　1.1α,25(OH)2D3可显著降低A549细胞经LPS刺激后炎症因子IL-8的表达水平(P<0.05),而25(OH)D3仅轻度降低IL-8的表达水平,且无统计学差异;1α,25(OH)2D3在七个不同干预时间点均可显著降低炎症因子IL-8的表达水平(P<0.05),其中在LPS刺激前24小时给药最为明显;三个不同给药浓度的1α,25(OH)2D3均可显著降低炎症因子IL-8的表达水平(P<0.05),其中高浓度组最为明显;1α,25(OH)2D3在LPS刺激后6小时及12小时两个时间点均可显著降低炎症因子IL-8的表达水平(P<0.05)。<br>　　2.LPS(1μg/ml)组细胞增殖活力较对照组明显下降(P<0.05),在LPS刺激前24小时给予1α,25(OH)2D3(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)干预与LPS刺激组比较未显著影响细胞增殖活力。<br>　　3.VDR和CYP27B1在人正常肺组织ATⅡ中均有表达,VDR表达于胞核和胞浆处,CYP27B1主要表达于细胞浆。与正常ATⅡ有所不同,A549细胞的VDR主要表达于核膜和胞浆处,并且在A549细胞中未检测到CYP27B1的表达。<br>　　4.1α,25(OH)2D3在30分钟和24小时可显著升高A549细胞和经LPS刺激后A549细胞IκB-α总蛋白的表达水平,而对NF-κBp65总蛋白的表达水平无显著影响;免疫荧光检测显示1α,25(OH)2D3可抑制LPS刺激后A549细胞NF-κBp65的核转位。<br>　　结论:<br>　　1.1α,25(OH)2D3可显著抑制LPS致伤A549细胞炎症因子IL-8的表达,抑制程度随给药浓度的增加而增强,并且在LPS刺激前24小时干预时其抗炎作用效果最为明显。<br>　　2.1α,25(OH)2D3对LPS致伤A549细胞的增殖活力无显著影响。<br>　　3.VDR和CYP27B1在人正常肺组织ATⅡ中均有表达,提示正常ATⅡ具有局部合成1α,25(OH)2D3的可能,而A549细胞仅表达VDR,未检测到CYP27B1的表达,这可能是给予25(OH)D3不能在A549细胞局部经CYP27B1催化为1α,25(OH)2D3,而发挥抗炎作用的原因之一。<br>　　4.1α,25(OH)2D3可能通过上调IκB-α蛋白的表达,抑制NF-κBp65的核转位,进而使其下游炎症因子IL-8的表达下调,从而发挥抗炎作用。