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摘要氧化应激与多种重大疾病的发生发展密切相关,严重威胁人类的身心健康。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂,在维持正常的氧化还原状态起着至关重要的作用。GCL是体内合成GSH的限速酶,包括催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM),其中GCLC具有GCL所有的催化活性,是合成GSH的首要限速步骤。课题组前期对大鼠GCLC上游1759bp调控序列研究发现近端存在2个相邻的E-box元件(-804～-779,-729～-724),均对GCLC的转录起抑制作用。进一步研究发现该基因上游含有众多可能的E-box元件核心序列,使得我们对其功能的研究的复杂性增加。因此有必要对GCLC上游调控序列中的重要位点的E-box元件进行更加缜密的分析。本课题构建GCLC上游不同长度(5892bp、1759bp、876bp)调控序列的荧光素酶报告载体,定点缺失不同E-box1(-804～-779)、E-box2(-729～-724)、E-box3(-590～-585),观察E-box元件的可能作用方式。同时对位于该基因上游-3853～-3848的高活性E-box元件进行考察,探讨该元件在GCLC基因表达的调控功能及可能机制。<br>　　目的：<br>　　分析GCLC上游近端876bp调控序列内3个E-box元件在GCLC基因表达调控中的作用,探索其可能的转录抑制机制;针对大鼠GCLC基因上游-3853～-3848的E-box元件,分析其功能特点及作用,了解GCL的转录调控特征。<br>　　方法：<br>　　1、荧光素酶报告载体的构建<br>　　为了解E-box元件在转录调控中的作用,需要利用荧光素酶报告基因对敲除E-box元件的上游调控序列进行转录活性检测,并对该元件不同序列直接进行分析。<br>　　(1)构建含大鼠GCLC基因上游5892bp调控序列的荧光素酶报告载体GCLC5892-luc和单缺失E-box2(-804～-779)、E-box3(-729～-724)以及双缺失E-box2、E-box3的GCLC5892-delE-box3-luc、GCLC5892-delE-box2-luc和GCLC5892-delE-box2/3-luc;<br>　　(2)构建含不同缺失E-box元件的大鼠GCLC基因上游1759bp和876bp调控序列的荧光素酶报告载体:分别以GCLC1759–luc、GCLC1759-del-E-box2-luc、GCLC1759-del-E-box3-luc、C1759-del-E-box2/3-luc为模板,设计引物,构建GCLC1759-del-E-box1-luc、GCLC1759-del-E-box1/2-luc、GCLC1759-del-E-box1/3-luc、GCLC1759-del-E-box1/2/3-luc、GCLC876-luc、GCLC876-del-E-box1-luc、GCLC876-del-E-box2-luc、GCLC876-del-E-box3-luc、GCLC876-del-E-box1/2-luc、GCLC876-del-E-box1/3-luc、GCLC876-del-E-box2/3-luc、GCLC876-del-E-box1/2/3-luc;<br>　　(3)人工合成含有E-box(-3853～-3848)序列及相邻序列的核苷酸片段,构建E-box(-3853～-3848)-luc、muE-box(-3853～-3848)-luc;<br>　　(4)构建突变ARE、E-box(-3853～-3848)元件的GCLC5892-muARE-luc、GCLC5892-muE-box(-3853～-3848)-luc报告载体。<br>　　2、调控序列在细胞内转录活性的测定<br>　　将成功构建的报告载体分别与PRL-SV40共转染L2细胞,24小时后检测荧光素酶活性,通过比较野生与突变报告载体的转录活性,以判断E-box元件对GCLC基因转录活性的影响。<br>　　3、为分析与E-box元件结合的转录因子的作用,共转染野生型载体GCLC5892-luc与转录因子DEC1、DEC2真核表达载体(PCMV-DEC1、PCMV-DEC2),检测DEC1、DEC2对GCLC转录活性的影响。<br>　　4、电泳迁移率分析(EMSA)和超级迁移率实验(Supershift assay)实验:进行EMSA观察E-box元件(-3853～-3848)是否能和核蛋白特异性结合;并用Supershift实验检测结合的转录因子是否DEC1、DEC2。<br>　　5、免疫蛋白印迹(Western Blot)方法检测细胞内DEC1、DEC2的表达对GCLC内源性表达的影响。<br>　　结果：<br>　　1、经测序鉴定,各种荧光素酶报告载体符合预期设计,成功构建。<br>　　2、(1)GCLC5892-luc、GCLC5892-delE-box2-luc、GCLC5892-delE-box3-luc和GCLC5892-delE-box2/3-luc转染L2细胞后,单缺失、双缺失E-box元件都能使荧光素酶活性显著上调(P<0.05),说明E-box2、E-box3元件在GCLC基因表达中起转录抑制作用,与课题组前期研究结论一致;<br>　　(2)各缺失E-box元件的荧光素酶报告载体转染L2细胞后,在大鼠上游1759bp和876bp调控序列中,无论是单缺失、双缺失还是三缺失E-box元件与野生型载体相比较,都使荧光素酶活性显著上调(P<0.05),说明这3个E-box元件均起转录抑制作用;<br>　　(3)E-box(-3853～-3848)-luc、muE-box(-3853～-3848)-luc、GCLC5892-muARE-luc、GCLC5892-muE-box(-3853～-3848)-luc、GCLC5892-luc转染L2细胞24h,突变E-box(-3853～-3848)载体与野生型载体相比较,荧光素酶活性显著上调(P<0.01),说明E-box(-3853～-3848)在GCLC基因表达中起转录抑制作用;而突变ARE元件后,荧光素酶活性显著下降(P<0.01),说明ARE元件是在GCLC基因表达中起转录促进作用,与文献报道相符。<br>　　3、将DEC1、DEC2真核表达载体(PCMV-DEC1、PCMV-DEC2)与GCLC5892-Luc共转染大鼠L2细胞并检测荧光素酶活性值,结果发现共转染了PCMV-DEC1、PCMV-DEC2细胞的荧光酶素活性较对照组PCMV的荧光素酶活性明显下降(P<0.01),这说明转录因子DEC1、DEC2的过表达对GCLC基因具有负性调控作用。<br>　　4、电泳迁移率变动分析(EMSA)结果显示E-box元件(-3853～-3848)能与L2细胞核蛋白特异结合,Supershift证实了E-box元件(-3853～-3848)特异性结合的结合转录因子有DEC1、DEC2。<br>　　5、免疫蛋白印迹(Western Blotting)检测到细胞内DEC1、DEC2的表达能降低GCLC的内源性表达。<br>　　结论：<br>　　1、GCLC基因上游-876～+1区段E-box1(-804～-779)、E-box2(-729～-724)、E-box3(-590～-585)元件在大鼠GCLC基因中属抑制元件,在GCLC基因基础状态表达中起负调控作用。<br>　　2、GCLC基因上游E-box元件(-3853～-3848)在大鼠GCLC基因中亦属抑制元件,转录因子DEC1与DEC2具有GCLC表达抑制活性,可能与E-box(-3853～-3848)有关。