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摘要【背景】<br>　　在中国,近30年来肺癌的死亡率上升了46.5％,发病率每年增长26.9%,已经替代肝癌成为我国恶性肿瘤死亡原因的第一位。在世界范围内,约有85%的新诊断肺癌是非小细胞肺癌(non–small-cell lung cancer,NSCLC),在非小细胞肺癌中约70%为肺腺癌。对于早期的非小细胞肺癌最有效的治疗手段是手术治疗,不能行手术治疗的肺癌患者只能选择药物化疗或放射治疗,但是化疗的总有效率也仅为30%左右,而即使一开始对化疗敏感的病人,最终也将出现获得性耐药,从而失去继续治疗的机会,这是导致肺癌高死亡率的重要原因。顺铂是肺癌治疗中最重要的药物,以顺铂为基础的两药化疗是肺癌的标准一线化疗方案,虽然许多新的、毒性更低的第二代、第三代铂类化疗药物早已被应用于临床,但仍无法替代顺铂在肺癌治疗中的地位,由此可见,研究非小细胞肺腺癌对顺铂耐药的机制,寻找可以预测顺铂治疗敏感性的标志物,探讨逆转顺铂耐药的方法,具有重要的意义。<br>　　MicroRNA(miRNA)是在真核生物中新发现的一类内源性非编码的单链小分子RNA,长度为19-25nt。miRNA本身并不编码蛋白质,而是在转录后水平通过与特异的靶mRNA的3'UTRs(untranslated regions)结合使之降解或者抑制其翻译,从而调控相关靶基因蛋白质的表达。许多的研究都表明在肿瘤细胞对顺铂耐药之后,miRNA表达谱发生了改变,这提示了可能miRNA在调控肿瘤细胞对顺铂的耐药中发挥着重要的作用。因此,我们希望能够通过研究耐药前后肿瘤细胞miRNA表达谱的差异,寻找可能与细胞产生顺铂耐药的特性有关的miRNA,并研究miRNA调控顺铂耐药的分子机制。<br>　　【目的】<br>　　寻找可以改变细胞对顺铂敏感的miRNA,并研究这些miRNA改变细胞对顺铂敏感性的分子机制,进而更全面地阐明肺癌顺铂耐药的机理,为寻找预测顺铂治疗敏感性的标志物和逆转细胞顺铂耐药提供一定的实验数据。<br>　　【方法】<br>　　1.利用qRT-PCR验证A549和A549/DDP细胞株的miRNA芯片检测结果;<br>　　2.通过脂质体瞬时转染miRNA的模拟物或抑制剂,CCK-8试剂盒检测改变miRNA的表达后,细胞对顺铂的敏感性有无改变。<br>　　3.流式细胞仪检测脂质体瞬时转染miRNA的模拟物或抑制剂后,细胞对顺铂敏感性的改变。<br>　　4.通过生物信息学软件预测miRNA的作用靶基因。<br>　　5.qRT-PCR检测增高或抑制miRNA的表达后,预测的靶基因的改变。<br>　　6.双荧光素酶报告系统检测miRNA与下游靶点是否为直接调控关系。<br>　　【结果】<br>　　1.qRT-PCR结果显示:mir-17/miR-20a/miR-20b的表达在耐药株细胞A549/DDP较非耐药株细胞A549中显著降低,与芯片结果相符合。<br>　　2.CCK-8试剂盒检测显示转染mir-17/miR-20a/miR-20b的模拟物后,顺铂耐药细胞株A549/DDP对顺铂的敏感性增加。<br>　　3.流式细胞仪检测细胞凋亡情况显示转染mir-17/miR-20a/miR-20b的模拟物后,顺铂耐药细胞株A549/DDP对顺铂的敏感性增加,凋亡增加。<br>　　4.利用生物信息学软件,预测mir-17/miR-20a/miR-20b的下游靶点,我们挑选了我院研究所发现的一个新基因TCRP1(tongue cancer resistance-associated protein 1)作为研究对象。<br>　　5.qRT-PCR检测结果显示转染mir-17/miR-20a/miR-20b的模拟物后,A549/DDP细胞株中TCRP1mRNA的表达水平下降。<br>　　6.分别构建带有野生型和突变型TCRP1基因的双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告系统检测显示TCRP1是mir-17/miR-20a/miR-20b的直接靶点。<br>　　【结论】<br>　　1.miR-17家族的表达与细胞对顺铂的敏感性相关。<br>　　2.在A549/DDP细胞株中高表达miR-17家族可以部分逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。<br>　　3.TCRP1是miR-17家族的直接靶点,并且miR-17家族可能是通过直接靶向TCRP1,下调其表达来改变细胞对顺铂的敏感性的。