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摘要目的:通过HLA-A2限制性survivin点突变抗原肽(Sur79M2)体外刺激T淋巴细胞,筛选特异性识别Sur79M2的TCR基因。构建TCR基因双表达载体,包装重组嵌合型腺病毒并转染T淋巴细胞,研究转Sur79M2特异性TCR基因T细胞的抗肿瘤功能,为今后点突变肿瘤相关抗原(TAA)的特异性T细胞过继性肿瘤治疗新方法和新型靶点TCR基因治疗药物奠定基础。<br>　　方法:<br>　　一.分离HLA-A2+健康人外周血单个核细胞(PBMC),体外诱导DC细胞,成熟DC细胞负载Sur79M2与T淋巴细胞共培养,对照组DC未负载Sur79M2与T淋巴细胞共培养。流式细胞术检测T细胞抗原受体(TCR)Vβ亚家族表达谱。<br>　　二.多重基因分析系统Gexp检测Sur79M2刺激的实验组及对照组T细胞抗原受体(TCR)Vα和Vβ亚家族表达格局。<br>　　三.提取实验组RNA,克隆Sur79M2特异性TCRVα和Vβ基因,构建重组嵌合型腺病毒穿梭质粒p315 TCRVα-IRES-Vβ。<br>　　四.通过Lipofectamine 2000脂质体转染的方法,将腺病毒骨架质粒与构建的腺病毒穿梭质粒p315 TCRVα-IRES-Vβ共转染HEK293细胞,包装表达目的基因的重组腺病毒。获得的初病毒提取病毒基因组DNA,PCR扩增目的基因及腺病毒骨架质粒纤毛基因进行鉴定。病毒转染淋巴细胞,检测目的基因的转染效率。将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒大量扩增,过滤TCID50法测病毒滴度。<br>　　五.腺病毒转染PBMC36小时后,分别作T2细胞负载Sur79M2(HLA-A2+、Survivin+)、肝癌细胞株HepG2(HLA-A2+、Survivin+)、乳腺癌细胞株Mcf-7(HLA-A2+、Survivin+)、肝癌细胞株7402(HLA-A2-、Survivin+)及肺癌细胞株NCI-H1299(HLA-A2-、Survivin-),12h、24h、36h三个时间点MTT检测杀伤效果及Elisa法检测IFN-γ的分泌。<br>　　结果:经DC负载Sur79M2刺激的PBMC流式检测TCRVβ亚家族表达情况发现TCRVβ7.1亚家族表达明显升高,而Gexp检测TCRVα和Vβ基因表达显示TCRVα4和Vβ7基因出现单一主峰的寡克隆峰图。克隆TCRVα4和Vβ7基因后测序分析CDR3序列证实TCRVα4和Vβ7基因发生了克隆增殖现象。构建腺病毒穿梭质粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7,包装重组嵌合型腺病毒,并从病毒中扩增出目的基因。重组嵌合型腺病毒转染淋巴细胞后流式检测能有效检测到目的基因的表达。MTT法检测杀伤效率依次为T2负载肽>HepG2(HLA-A2+、Survivin+)>Mcf-7(HLA-A2+、Survivin+)>7402(HLA-A2-、Survivin+)>NCI-H1299(HLA-A2-、Survivin-),IFN-γ的分泌情况几乎与MTT杀伤效率一致。<br>　　结论:通过DC负载Sur79M2体外刺激T淋巴细胞的方法,成功筛选到Sur79M2特异性TCRVα4和Vβ7基因。克隆特异性TCRVα4和Vβ7基因并成功构建了重组嵌合型腺病毒穿梭质粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7。体外抗肿瘤功能研究中Sur79M2特异性TCRVα4和Vβ7基因显示出有效识别及杀伤负载了Sur79M2T2细胞的能力,而且对于表达野生型survivin抗原的肿瘤细胞株也具有一定的活化杀伤功能。