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摘要百日咳是由百日咳鲍特氏菌(简称百日咳杆菌)引起的一种急性呼吸道传染病,其中尤以婴幼儿多见。该病原菌在侵袭宿主时能产生百日咳毒素、腺苷酸环化酶毒素(adenylatecyclasetoxin,ACT/CyaA)等多种毒力因子,这些生物活性分子在其致病过程中发挥着重要作用。ACT属于细菌成孔毒素RTX(repeatintoxin)家族的成员之一,其生物活性包括C端(400-1706aa)溶血活性(hemolyticactivity)和N端(1-400aa)的腺苷酸环化酶活性(adenylatecyclaseactivity)。尽管研究证实ACT蛋白参与百日咳杆菌感染宿主时的免疫调节,但其在细菌感染中的作用机制还不是完全清楚;此外,现行欧洲药典明确指出在百日咳疫苗生产中应监测细菌毒力因子ACT蛋白,以加强疫苗的质量控制,但目前我国并没有相关检测ACT的方法。针对上述研究现状,本课题应用DNA重组技术,原核表达并纯化重组ACT蛋白,通过基因水平的突变得到不同形式的ACT蛋白,并从细胞毒性和腺苷酸环化酶活性两方面对重组ACT的活性进行鉴定,研究分析ACT调节固有免疫应答的功能特性,初步探讨其在百日咳感染中的作用机制;同时应用纯化重组蛋白制备ACT特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,建立检测ACT的ELISA方法,并对方法进行验证。<br>　　一、百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素的重组表达和纯化<br>　　根据已知的ACT及其修饰蛋白CyaC的基因序列设计、合成引物,进行PCR扩增,并将上述两种目的基因特异性扩增产物连接到同一双表达质粒pETduet-1中;重组质粒转化感受态BL21(DE3),经氨苄青霉素抗性筛选,PCR、酶切和测序鉴定为阳性的克隆,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导ACT和CyaC表达;采用硫酸铵沉淀法和DEAE离子交换层析法对ACT蛋白进行纯化。成功构建了ACT及其修饰蛋白CyaC的共表达体系,最终获得了大量高纯度的重组ACT蛋白。纯化的重组蛋白进行了SDS-PAGE、ELISA和WesternBlot检测分析,结果显示重组ACT与百日咳临床分离株全菌体免疫小鼠血清以及全细胞百日咳疫苗免疫血清均存在较强抗原抗体反应,同时与共纯化无细胞百日咳疫苗免疫小鼠血清之间存在一定抗原抗体反应。应用亲和层析法对重组蛋白进行了细菌内毒素(endotoxin)的去除处理,并通过鲎试验法对处理前后样品中残余的内毒素进行了测定,结果显示成功去除了重组蛋白中绝大部分的内毒素,每微克蛋白中内毒素浓度仅为145.5pg。<br>　　二、重组腺苷酸环化酶毒素蛋白特性和功能分析<br>　　采用噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)检测试验和乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)释放测定试验检测分析重组ACT作用于J774A.1鼠巨噬细胞的毒性反应,同时分析J774A.1细胞内cAMP水平的变化和BHK21细胞形态变化,评价重组ACT的腺苷酸环化酶活性。结果显示ACT作用于J774A.1细胞后,可引起其细胞内cAMP浓度的上升,并释放出LDH,表明重组ACT具有较强的细胞毒性和腺苷酸环化酶活性,且随着其浓度的增加,细胞毒性增强。而突变缺失腺苷酸环化酶活性的重组ACT蛋白作用相同时间后未检测到cAMP浓度的上升。此外,ACT蛋白作用于BHK21细胞能引起该细胞形态变化,由典型的两极化纤维母细胞形态变为不规则的星形,部分细胞死亡,也间接表明了本研究制备重组蛋白具有腺苷酸环化酶活性。为了评价重组ACT的免疫调节功能,我们将重组ACT和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)分别单独刺激和共同刺激小鼠腹腔巨噬细胞,采用WesternBlot检测细胞内激酶活化水平,结果与单独刺激组比较,共同刺激组的p-NF-κB水平明显增加,p-p38和p-JNK轻度增加;采用ELISA法检测细胞上清中的细胞因子,结果共同刺激的细胞分泌IL-1β、IL-6和IL-10明显增多,TNF-α和IL-12明显减少,与LPS单独刺激比较,呈现显著性差异(P<0.01)。此外,ACT单独作用也能诱导较高水平的IL-6的分泌,与共同刺激组比较,无显著性差异(P>0.05)。<br>　　三、抗ACT抗体的制备及其检测方法的建立<br>　　采用杂交瘤细胞术建立了四株分泌抗ACT的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过杂交瘤细胞诱生腹水大量制备了四株ACT特异性的小鼠单克隆抗体,各株腹水效价均在1:104以上。同时经多次免疫获得ACT特异的兔多抗血清。之后分别采用辛酸-硫酸铵沉淀法和蛋白A亲和层析法纯化单抗和多抗,纯化后抗体纯度达90％以上。对抗体进行了浓度测定,并采用SDS-PAGE、ELISA、狭缝杂交和WesternBlot方法对抗体纯度、分子量、抗原特异性和效价等进行了鉴定,结果显示抗体与重组ACT特异性反应。筛选了两株识别不同位点(阻断抑制率均大于75%)的两株单抗,矩阵法确定了3F9作为包被抗体,其最佳工作浓度为5μg/ml;而辣根过氧化物酶标记的1B8作为检测抗体,其最佳工作浓度为1:5000倍稀释,约为2μg/ml。建立的定量检测ACT的ELISA方法,灵敏度为1.17μg/L;平均批内变异系数(CV)为9.93%,平均批间变异系数(CV)为10.24%;平均回收率为103.24%;且方法有良好特异性,与百日咳杆菌主要抗原百日咳毒素、百日咳粘附素、丝状血凝素、凝集原和气管定植因子均无交叉反应。<br>　　本研究成功构建了ACT及其修饰蛋白CyaC的共表达体系,并经原核表达和纯化获得了大量较高纯度的重组ACT蛋白,为后续开展ACT相关研究奠定了基础;对制备的重组ACT蛋白进行了系统地活性分析,证实了重组ACT具有细胞毒性和腺苷酸环化酶活性;ACT能减弱LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-12和TNFα等促进免疫应答的细胞因子能力,而增强其分泌抑制型细胞因子IL-10的能力,进一步验证了ACT可通过Toll样受体(Toll-LikeReceptor,TLR)介导的信号传导途径影响固有免疫应答。实验室前期研究结果显示ACT与TLR通路中的含有TIR结构域的接头蛋白(TIRdomaincontainingadaptorprotein,TIRAP)相互作用,这些研究结果将有助于揭示ACT如何介入TLR途径,洞悉其调节免疫应答的具体机制。此外,本研究获得了纯度和特异性均较好的ACT单克隆和多克隆抗体,并建立了特异、准确的定量检测ELISA方法,为加强无细胞百日咳疫苗的质量控制提供了物质基础。