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摘要2006年英国发生的TGN1412I期临床严重不良反应事件表明,对于作用于免疫系统的药物,急需建立完善的临床前免疫毒性评价检测方法及动物模型,寻找灵敏可靠的免疫毒性生物标志物,以期准确地预测临床不良反应。<br>　　由于目前除细胞因子外,临床上尚未有作用明确的小分子免疫增强药物,而佐剂是能够增强机体免疫反应的物质。因此我们选择几种佐剂作为免疫增强剂,使用基因芯片技术研究佐剂对免疫系统相关基因表达谱的影响,从基因水平上寻找与免疫增强相关的差异表达基因生物标志物;同时结合传统免疫毒性评价技术从免疫器官、免疫细胞、免疫分子、整体免疫功能等各个水平对机体免疫状态进行全面评价;通过体外模型进行对比和验证性研究,进一步研究和阐明不同佐剂的作用机理,为疫苗研发中佐剂的合理选择提供参考。<br>　　1.研究方法:<br>　　体内实验:8-10周龄的雌性BALB/c小鼠分别肌肉注射PBS、铝佐剂(10mg/kg)、不同剂量的PolyI:C(0.25,2.5,10mg/kg)和CpG-ODN(0.1,1,5mg/kg),分别于给药后1h,3h,6h,24h,72h取血解剖,称量免疫器官重量,对免疫器官进行组织病理学检查;T细胞依赖性抗体反应(Tcelldependentantibodyresponse,TDAR)检测,综合评价机体整体免疫功能;取脾脏使用流式细胞术进行细胞表型分析,使用Luminex液相芯片技术检测血浆中细胞因子含量,使用基因芯片技术研究小鼠脾脏基因表达谱的变化情况。<br>　　体外实验:8-10周龄的雌性BALB/c小鼠,无菌分离脾脏,制备脾细胞悬液,用细胞培养基,铝佐剂(0.04mg/ml),不同浓度的PolyI:C(0.05,0.25mg/ml)和CpG-ODN(0.005,0.025mg/ml)分别刺激小鼠原代脾细胞,各佐剂刺激1h,3h,6h,12h,24h,72h后检测细胞存活率。给药刺激6h后提取细胞RNA,使用基因芯片技术检测脾细胞全基因表达谱的变化。<br>　　2.研究结果:<br>　　体内实验:给药后72h,PolyI:C和CpG-ODN使脾脏重量增加。给药后24hPolyI:C与CpG-ODN脾脏白髓易染体巨噬细胞数目增多以及副皮质区易染体巨噬细胞数目增多。TDAR检测结果发现,PolyI:C和CpG-ODN均能提高小鼠抗KLH特异性IgG的抗体滴度。给药后6h,PolyI:C和CpG-ODN增加脾脏CD69、CD86阳性细胞比例;三种佐剂均升高血浆中促炎细胞因子和趋化因子水平;PolyI:C上调干扰素相关基因,MHCI类基因,促进以MHCI类途径加工和提呈抗原,诱发T细胞介导的细胞毒作用以及Th1型免疫应答。CpG-ODN在较高剂量下上调干扰素相关基因,启动细胞因子介导的信号通路以及B细胞受体信号通路,促进T、B细胞增殖。铝佐剂对脾脏几乎无免疫刺激作用。<br>　　体外实验:CpG-ODN在给药后期能显著促进细胞增殖。基因芯片检测结果与体内实验具有较好的一致性,PolyI:C显著上调干扰素相关基因,MHCI类基因,促进T细胞的增殖。CpG-ODN在较高剂量下上调干扰素相关基因,促进B细胞的活化,T细胞的增殖。铝佐剂引起的差异基因与佐剂的相关性不强。<br>　　3.结论:CpG-ODN、PolyI:C和铝佐剂均有明显的免疫增强作用,小鼠脾脏全基因表达谱的变化与TDAR检测、细胞因子检测、免疫细胞亚群分析、组织病理学检查结果等具有较好的一致性,其中PolyI:C和CpG-ODN比铝佐剂能更好的激活机体的细胞免疫反应。体外直接刺激脾细胞引起的基因变化与体内刺激引起的基因变化具有较高的一致性。本研究为基因芯片技术在免疫毒性评价中的应用和潜在相关生物标志物的研究奠定了基础,比较全面的评价了不同类型佐剂的免疫作用机制,为疫苗研发时选择合适的佐剂提供了依据。