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假单胞菌M18 gacS和gacA基因的克隆、蛋白表达与纯化研究

摘要感受激酶GacS(global activator sensor kinase)和反应调控因子GacA(global antibiotic and cyanide control)是双元调控系统(two-component regulatory system)的两个组分。GacS/GacA系统调控胞外生防因子和致病因子的合成,是抗生素等次级代谢产物合成所必需的。在许多革兰氏阴性菌中,保守的双组分调控系统GacS/GacA对细菌胞外产物的合成与分泌具有决定性的控制作用。如在一些植物、动物和人的病原菌中,当gacS或者gacA基因发生突变时,突变株的多种胞外产物分泌受到不同程度的抑制,对植物、动物和人的致病性也显著降低。目前对GacS、GacA蛋白的研究主要是对gacS、gacA基因突变,分析突变对细胞胞外产物等各个方面的影响。尚无对GacS、GacA蛋白的直接获得及研究。因此,gacS、gacA的克隆、表达与纯化及深入的研究是一个极富意义的研究领域。本课题对双元调控系统的gacS和gacA进行克隆、蛋白表达与纯化研究。以假单胞菌M18全基因组为模板,pET28b(+)为载体,克隆gacS、gacA基因。将重组质粒pET/gacA经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,GacA蛋白得到可溶性表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,蛋白纯度约为95%,MALDI-TOF鉴定证明纯化的蛋白为假单胞菌M18GacA蛋白。对GacA进行热稳定性分析,GacA蛋白不耐高温,40℃10min即变性沉淀。GacA结合在NTA-Ni柱上,M18菌体蛋白通过NTA-Ni-GacA柱,截留的肽段有几丁质酶、50S核糖体蛋白L25、热休克蛋白90、顺乌头酸水合酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、过氧化物还原酶亚基C、延伸因子G。这七种蛋白可能与GacA有相互作用,但是该实验只是初步探索,需要进一步做大量的实验研究来进行验证。UCLA-DOE预测gacS基因中含有38个稀有密码子,所以在大肠杆菌BL21(DE3)中不能被诱导表达,将重组质粒pET/gacS经热激转化至大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中,IPTG诱导表达,膜蛋白GacS以包涵体形式表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,蛋白纯度约为90%。GacS用TMHMM2.0预测蛋白跨膜结构,氨基酸11-33及168-187为GacS的跨膜结构。

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