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摘要肺结核是长期严重危害人类健康的慢性传染病,也是单因素所致感染性疾病中病死率最高的疾病之一。结核性胸膜炎作为肺外结核的类型之一,约占肺结核患者的10％-20％,其中约10％-30％的结核性胸膜炎患者临床有胸腔积液表现。结核性胸腔积液作为常见的渗出性胸腔积液之一,胸水Th1细胞介导的免疫反应起主导作用,但近来研究结果表明,除了Th1型免疫反应,Th2、Th9、Th17、Th22等免疫细胞亚群及协同刺激分子在结核性胸腔积液的发生、发展中亦具有重要的作用。研究发现,协同刺激分子PD-L1(programmed death-1 ligand1,程序性死亡配体1,又名B7-H1)在激活的T淋巴细胞、B淋巴细胞及单核-巨噬细胞等多种免疫细胞表面表达增高,并与机体的免疫抑制相关。业已证明,肺结核患者外周血中PD-1、PD-L1表达显著增高,可能与结核病免疫耐受及慢性化炎症相关。许多协同刺激分子如OX40、OX40L(OX40配体)、B7-H3和CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4)等除膜型外,还以可溶性的形式存在。既往对肺癌患者外周血可溶性PD-L1(sPD-L1)检测发现,肺癌患者血清sPD-L1表达异常增高,并与肿瘤分期、转移和疗效相关。而胸腔积液中是否存在sPD-L1及sPD-L1在结核性胸腔积液中的生物学意义的研究并不多见。<br>　　本研究中,我们采用苏州大学生物技术研究所自主研发的特异性人sPD-L1的酶联免疫吸附法(ELISA)检测体系对结核性胸腔积液患者开展深入研究,检测结核性胸腔积液中sPD-L1的表达,分析其临床指导意义,揭示sPD-L1和PD-1/PD-L1协同刺激信号与结核性胸腔积液疾病发生、发展的关系,进一步探究sPD-L1在结核性胸腔积液中的生物学意义。为免疫学方法在结核性胸腔积液中的治疗提供依据。<br>　　一、可溶性PD-L1在结核性胸膜炎患者胸腔积液和外周血中的表达水平及临床意义<br>　　【目的】检测结核性胸膜炎患者胸腔积液和外周血中可溶性PD-L1的表达水平并探讨其临床意义。<br>　　【方法】筛选2012年6月至2013年3月苏州大学附属第二医院呼吸科收治的初诊胸腔积液患者68例,其中结核性胸腔积液组共24例,恶性胸腔积液组共30例,非结核、非恶性胸腔积液组14例。收集上述人群胸腔积液和外周血清并记录其临床资料。采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测胸腔积液和外周血中sPD-L1的水平。流式细胞法(FCM)检测胸腔积液和外周血中CD4+T细胞的表达、CD8+T细胞的表达、PD-1在CD4+T细胞上的表达(CD4+-PD-1)、PD-1在CD8+T细胞上的表达(CD8+-PD-1)、CD14+单核细胞和PD-L1在CD14+单核细胞上的表达(CD14+-PD-L1)。反转录PCR法检测胸腔积液中PD-L1、基质金属蛋白酶3(MMP-3)基因表达。受试者工作特征(ROC)曲线分析sPD-L1对结核性胸腔积液的诊断价值。<br>　　【结果】结核性胸腔积液中sPD-L1含量显著高于恶性组和非结核、非恶性组(P<0.0001);所有患者胸腔积液中的sPD-L1平均含量显著高于外周血中(P=0.0033)。结核组胸腔积液中CD8+细胞比例和PD-L1在CD14+单核细胞表达(CD14+-PD-L1)比例均高于恶性组及非结核、非恶性组(P=0.0001,P<0.0001)。反转录PCR结果显示结核性胸腔积液中PD-L1 mRNA表达增高,且与MMP-3表达水平相关(r=0.887,P<0.0001)。ROC曲线分析显示,单因素检测胸腔积液sPD-L1诊断结核性胸腔积液的敏感度为82.6％,特异度为82.9％,曲线下面积为0.840。<br>　　【结论】 sPD-L1反映了不同病因胸腔积液微环境中不同的免疫功能状态,结核性胸腔积液中sPD-L1表达明显增高,可能与结核性胸腔积液的发生、发展相关,胸水中sPD-L1检测有助于结核性胸腔积液的鉴别诊断。<br>　　二、结核性胸腔积液中IFN-γ和IFN-α的表达及PD-1/PD-L1协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫学作用<br>　　【目的】检测结核性胸腔积液中IFN-γ和IFN-α的表达水平并分析其临床意义;探讨PD-1/PD-L1协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫学作用。<br>　　【方法】收集上述68例胸腔积液患者胸腔积液标本,采用ELISA法检测胸腔积液中IFN-γ和IFN-α的表达水平。分离健康成人外周血单个核细胞(PBMCs),以不同浓度结核性胸腔积液刺激培养后采用流式细胞术(FCM)检测PBMCs细胞表面PD-L1的表达变化,CCK-8掺入法检测PBMCs增殖的改变。免疫磁珠法分选结核性胸腔积液中T淋巴细胞和CD14+单核细胞,CCK-8掺入法检测共培养体系中T细胞增殖的改变。<br>　　【结果】结核性胸腔积液组中IFN-γ含量显著高于恶性组和非结核、非恶性组(P<0.0001);而三组患者胸腔积液中IFN-α含量无统计学差异(P>0.05)。胸腔积液中sPD-L1表达与Th1型主要细胞因子IFN-γ及胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)表达成正相关(P=0.0004,P<0.0001)。联合胸腔积液sPD-L1、CD14+-PD-L1、IFN-γ及ADA可使诊断结核性胸腔积液的敏感度达87.0％,特异度达100％,曲线下面积达0.981。结核性胸腔积液可体外刺激CD14+单核细胞表面PD-L1的表达及PBMCs的增殖。高表达PD-L1的胸腔积液单核细胞能通过PD-1/PD-L1信号抑制T淋巴细胞的增殖和活化,采用抗PD-L1抗体特异性阻断该抑制信号可部分恢复T淋巴细胞的增殖活性(P=0.005)。<br>　　【结论】结核性胸腔积液中IFN-γ表达增高,与胸腔积液中sPD-L1表达成正相关;联合IFN-γ及各临床指标检测有助于结核性胸腔积液的鉴别诊断;高表达的Th1型细胞因子IFN-γ可能与PD-1/PD-L1协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫作用相关。<br>　　综上所述,本课题研究获得了以下研究结果:(1)结核性胸腔积液中sPD-L1、Th1型细胞因子IFN-γ、CD8+细胞表达和PD-L1在CD14+单核细胞表达增高,sPD-L1单因素检测或联合各临床指标有助于结核性胸腔积液的诊断。(2)结核性胸腔积液可体外促进CD14+单核细胞表面PD-L1的表达及外周血单个核细胞的增殖,增高表达的PD-L1与T细胞表面PD-1受体相结合,抑制了机体的免疫效应,可能与结核性胸腔积液的发生、发展相关。(3)通过抗PD-L1单抗阻断PD-1/PD-L1途径可部分恢复T淋巴细胞增殖能力,为结核性胸腔积液的免疫治疗提供了依据。