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摘要目的：在自然界细菌以单个游离悬浮状态和生物膜(biofilm,BF)状态两种形式存在。与浮游细菌相比,处于BF状态的细菌对不利条件,如干燥、极端温度、抗菌药物和消毒剂的抵抗力均明显增强。感染了BF的机体和污染了BF的生物材料,即使应用正常剂量数百倍的抗菌药物也难以奏效,因而常导致迁延难治性感染或严重公共卫生事件。伤寒沙门菌质粒pRST98是一种同时编码细菌耐药性和毒力的“嵌合性”质粒,在实验室和小鼠体内很容易通过接合作用从伤寒沙门菌(Salmonella typhi, S. typhi, ST)传递至鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium, S. typhimurium, STM)、大肠埃希菌(Escherichia coli, E. coli)和痢疾杆菌等,且这些细菌彼此之间还可互相传递,导致宿主菌耐药性和毒力增强。由于伤寒沙门菌只感染人类,没有合适的动物模型,因此在本课题中,通过接合转移将pRST98分别转移至受体菌形成接合子STM/pRST98和E. coli/pRST98进行研究。本研究第一部分探讨伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响,比较受试菌 STM, STM/pRST98,E. coli和E. coli/pRST98在浮游状态和BF状态下,细菌粘附侵袭、抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬能力的的差异。本研究第二部分以 E. coli和 E. coli/pRST98为研究对象,通过构建小鼠泌尿道插管模型,研究伤寒沙门菌质粒pRST98对E. coli在小鼠体内形成BF的影响。<br>　　方法：⑴按常规方法将受试菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98增菌,制备单个游离悬浮状态的细菌菌液;将受试菌分别在常规条件下培养3 d形成成熟BF,使用超声法将BF中的细菌均匀分散后,制备BF状态下的菌液。将游离细菌与BF细菌使用OD法和平板菌落计数法(colony-forming unit, CFU)确定浓度后,分别与小鼠结肠癌细胞CT26进行粘附侵袭、血清杀菌以及抗巨噬细胞吞噬实验,分别比较不同状态下受试菌毒力的差异以及pRST98对不同状态下宿主菌毒力的影响。⑵将实验菌株STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98按感染复数(multiplicity of infection, MOI)100:1与CT26细胞共培养1 h后,弃去菌液后用PBS洗涤细胞,破膜后用CFU比较受试菌对细胞的粘附力。侵袭实验与粘附实验基本相同,但在细菌细胞共培养1 h后弃去菌液用PBS洗涤3次后每孔加入含阿米卡星(100μg/ml)的细胞培养液,作用3h后进行细胞内活菌计数。⑶用OD法和CFU法将不同状态的受试菌稀释至1×104 CFU/ml,吸取20μl菌液分别加入含不同稀释度的兔和豚鼠血清0.2 ml的试管,不含血清的普通肉汤管做CFU对照,根据预实验结果选择37℃,2 h作为杀菌作用时间。用平板菌落计数法计算存活细菌数。⑷STM作为兼性厌氧胞内菌,可在巨噬细胞内存活。用OD法和CFU法将浮游状态和BF状态下受试菌浓度调整至107 CFU/ml待用。用血细胞计数板计数后将小鼠巨噬细胞J774A.1细胞浓度调整至5×105个/ml,分别加入6孔板,每孔1 ml。将1 ml不同状态的受试菌加入到各孔中,与细胞共作用1 h。用含阿米卡星(100μg/ml)的RPMI1640培养液离心洗涤除去胞外菌,重新悬浮于含阿米卡星的培养液中,在不同时间点裂解细胞做CFU检测胞内活菌数。⑸PE10塑料导管经消毒处理后分别于1×107 CFU/ml的E. coli和E. coli/pRST98菌液中浸润24 h,使受试菌粘附于导管表面。雌鼠进行麻醉、固定及消毒后,将准备好的PE10导管插入小鼠尿道并轻推至膀胱中。根据感染细菌的不同将小鼠分为两组,每组6只,实验重复3次。⑹感染后第5 d小鼠经麻醉处死,将PE10导管从体内取出后用PBS洗涤,置于适量浓度为0.01％的吖啶橙染液中,于黑暗中静置染色10 min再用PBS洗涤,将染色的导管置于载玻片上镜下观察。⑺将插管后第5天的小鼠麻醉后处死,取出膀胱中的PE10导管,用PBS轻柔洗涤,用2.5％的戊二醛溶液固定,用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗后,用1％锇酸后固定1 h,再用连续梯度的叔丁醇溶液脱水,将导管取出进行临界点干燥和镀金后于SEM下观察导管表面BF的形态。⑻按上述方法取得导管后,经PBS轻柔漂洗后置于1.0 ml PBS超声振动20 min,使生物膜中的细菌均匀分散至溶液中,进行CFU计数生物膜中的活菌数量。⑼插入导管后第8d经麻醉处死小鼠,肉眼观察小鼠的肝脏、肾脏和脾脏的病变。取其肝脏和肾脏固定于10％的甲醛中,经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等步骤,切片经HE染色后于显微镜下观察。<br>　　结果：①实验结果显示除E. coli外,各受试菌在BF状态下对细胞的粘附力明显增强,在BF状态和浮游状态下,pRST98对宿主细菌的粘附力无明显影响(p>0.05)。在两种不同状态下,与E. coli相比,STM对CT26细胞的粘附力更强。侵袭实验结果表明,形成BF后STM对CT26细胞的侵袭力明显下降(p<0.01),E. coli组,也有相似趋势(p<0.05)。另外,pRST98在BF和浮游状态下对宿主菌侵袭CT26细胞的能力均无明显影响。STM对CT26细胞的侵袭能力强于E. coli(p<0.05)。②BF状态的受试菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98在兔血清和豚鼠血清中的存活率均高于浮游状态的受试菌(p<0.05)。在BF状态下,STM/pRST98和E.coli/pRST98抗兔血清和豚鼠血清杀菌能力亦分别明显高于STM和E. coli(p<0.05)。STM对血清杀菌的抵抗力显著高于E. coli(p<0.05)。③BF状态下的STM在巨噬细胞内的存活率明显高于浮游状态下的细菌,说明在BF状态下细菌抗巨噬细胞吞噬能力增强,差异有统计学意义(p<0.05)。另外,可以发现BF和浮游状态下,STM/pRST98在巨噬细胞内的存活率均高于STM(p<0.05)。④成功建立小鼠插管模型。小鼠插管后活动正常,麻醉后处死小鼠从小鼠膀胱中取出导管。插管后第5 d,E. coli和E. coli/pRST98可以在导管上形成BF,通过CLSM可以观察到E. coli/pRST98在导管表面形成的BF荧光信号明显强于E. coli。SEM下观察导管表面形成的生物膜发现,E. coli/pRST98感染组细菌聚集成团,形成成片的BF,而E. coli感染组细菌只是散落分布于导管表面不能形成明显的BF。CFU定量检测导管表面活菌数结果显示,E. coli/pRST98在导管上的定值数量明显高于E. coli(p<0.05)。⑤E. coli/pRST98感染组小鼠皮毛黯淡,精神萎靡,活动迟缓。感染后第8 d将小鼠麻醉处死解剖后见小鼠肝脏、肾脏和脾脏明显充血肿大,表面有多发性小脓肿;病理切片HE染色后见小鼠肝脏细胞浊肿,肝小叶结构破坏且有炎性细胞浸润,肾脏有大量淋巴细胞浸润,肾小球结构破坏。E. coli感染组小鼠皮毛、精神及活动均正常,感染后第8d将小鼠麻醉处死解剖后见小鼠肝脏、肾脏和脾脏稍肿大,但无多发性小脓肿;病理切片HE染色可见小鼠肝细胞水样变性和炎症细胞浸润,肾脏细胞水样变性及淋巴细胞浸润。<br>　　结论：⑴BF的形成在促进细菌对小鼠结肠癌细胞CT26粘附的同时降低了细菌对细胞的侵袭。⑵BF形成能显著增强细菌抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬的能力,使毒力增强。⑶伤寒沙门菌质粒pRST98能增强浮游和BF状态下STM和E. coli对血清杀菌和巨噬细胞吞噬的抵抗力。⑷伤寒沙门菌质粒pRST98能促进E. coli在小鼠体内形成BF。