换一批
换一批摘要目的:单增李斯特菌表面蛋白MurA可作为检查的标志分子,原核表达MurA,制备鼠多克隆抗体,将抗体与磁珠偶联制成单增李斯特菌免疫磁珠,将免疫磁珠富集技术结合选择性平板培养法,建立免疫磁珠-选择性平板快速检测技术,以缩短增菌耗时和提高特异性。<br> 方法:设计MurA蛋白的基因引物,PCR扩增后,将MurA基因插入原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌进行优化表达;表达产物经镍柱纯化,质谱分析后免疫小鼠,制备抗MurA的多克隆抗体;通过间接ELISA方法,分析多抗效价及交叉性;用多抗制备MurA特异性免疫磁珠,建立单增李斯特菌免疫磁珠-选择性培养基检测方法,并对人造污染牛奶样品进行检测。<br> 结果:上清中见72kD的可溶性诱导蛋白表达,经质谱鉴定其为MurA蛋白;3次免疫小鼠后,MurA抗血清效价达1:10000,与伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆菌及属内其它病原菌均无交叉反应,显示了良好的特异性;用该抗血清制备的免疫磁珠结合选择性培养基检测法。单增李斯特菌浓度≥103 CFU/mL均能检出,与英诺克李斯特菌存在轻微交叉反应;仅需9h增菌可检出牛奶样品,较传统方法可将增菌时间缩短39 h,减少3/4以上的耗时;检测限为0.4 CFU/mL。<br> 结论:成功表达并经镍柱纯化得到高纯度的单增李斯特菌MurA蛋白,制备的鼠源抗MurA多克隆抗体亲和力高,特异性好;将制备的免疫磁珠结合选择性培养基法快速检测方法,24 h内完成对牛奶样品的检测,较国标法减少42 h(3/4)以上。
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