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摘要研究背景:<br>　　缺血性心脏病(ischemia heart disease,IHD)是危害人类健康的第一杀手。IHD的治疗的关键是恢复血液供应,然而心肌在恢复血供后常损伤加重,即缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)。IRI是IHD和心脏手术患者预后不良的重要原因。目前用于防治心肌IRI的药物众多,但是由于副作用、安全、伦理等问题,至今未能获得理想的药物心肌保护方法。近年来一些天然物质成为抗心肌IRI领域研究的热点,这源于这些物质既具备安全无毒的优点,还具备强大的抗炎、抗氧化应激和抗凋亡的特性。姜黄素(curcumin,Cur)是从姜科、天南星科植物的根茎中提取的有效的天然物质。既往研究发现姜黄素具有多重心血管保护效应,且副作用小、经济、安全,是当前心血管疾病研究领域极具开发前景的天然药物。然而,姜黄素抗心肌IRI的心肌保护机制不清,成为限制其进一步研究开发和临床应用的瓶颈。<br>　　酪氨酸蛋白激酶2/信号转导子和转录激活子3(janus activated kinase signal transducer2 and activator of transcription3,JAK2/STAT3)是JAK/STAT家族重要的信号通路。研究发现缺血预处理(ischemia preconditioning,IPC)、缺血后处理以及一些药物的抗心肌IRI作用都与激活JAK2/STAT3通路有关。值得注意的是,肿瘤等相关研究发现:姜黄素的药理学作用与调控 JAK2/STAT3通路密切相关。所以我们推测姜黄素可能通过调控JAK2/STAT3通路发挥抗心肌IRI作用。<br>　　沉默信息转录调控因子1(silent information regulator of transcription1,SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC),研究发现SIRT1以组织特异性方式调节细胞的增殖、凋亡、分化、衰老和代谢。近年来研究发现SIRT1在心血管疾病中发挥重要调控作用。叉头转录因子1(forkhead box transcription factor O1,FOXO1)是SIRT1的重要底物,SIRT1可以通过调节FOXO1乙酰化水平影响心肌中的凋亡通路。IPC和白藜芦醇可以通过激活SIRT1发挥抗心肌IRI的作用。姜黄素和白藜芦醇都属于多酚类的物质,而且这两种物质对SIRT1的活性都有调节作用。激活SIRT1还可以减轻OSI和维持线粒体功能。肿瘤、肝脏、血液等疾病的研究发现:JAK2/STAT3和SIRT1通路存在交互(Cross-talking)作用,然而这这两者在心脏病理生理过程中的关系尚不清楚。<br>　　综上,因此我们提出:姜黄素可能通过激活JAK2/STAT3和(或)SIRT1通路发挥抗心肌IRI作用,且SIRT1可能与JAK2/STAT3通路发挥交互(Cross-talking)作用,并最终通过减轻线粒体氧化应激损伤和抗凋亡途径发挥心肌保护作用。本项目将采用一系列研究模型和实验方法,阐明JAK2/STAT3和SIRT1介导姜黄素抗IRI的具体机制。本研究希望获得抗心肌IRI的药物作用新靶点,为研发以姜黄素为基础的药物心肌保护方法提供理论依据。<br>　　研究目的:<br>　　1.明确姜黄素是否具有抗心肌 IRI作用,进一步明确姜黄素是否通过调控JAK2/STAT3通路发挥抗心肌IRI的保护作用。<br>　　2.明确姜黄素是否通过调控SIRT1通路发挥抗心肌IRI的保护作用。<br>　　3.明确JAK2/STAT3和SIRT1通路在正常心肌细胞或者姜黄素抗心肌IRI过程中的交互(Cross-talking)或上下游关系。<br>　　研究方法:<br>　　第一部分:研究姜黄素抗心肌IRI作用及JAK2/STAT3信号通路是否参与姜黄素的心肌保护作用观察姜黄素对IRI离体心脏和乳鼠心肌细胞各项指标的影响,明确姜黄素抗心肌IRI作用;同时观察该过程中姜黄素对JAK2/STAT3相关分子影响,初步探明姜黄素心肌保护作用是否与JAK2/STAT3通路相关。进一步用JAK2/STAT3通路特异性阻断剂AG490或者JAK2 siRNA在离体心脏或心肌细胞水平阻断JAK2/STAT3通路,观察其对姜黄素抗心肌IRI作用的影响,明确姜黄素是否通过调控JAK2/STAT3通路发挥心肌保护作用。<br>　　1.观察不同浓度姜黄素对离体心脏IRI的影响及其对JAK2/STAT3通路的影响。实验分为4组:①IR;②Cur0.25μM+IR;③Cur0.5μM+IR;④Cur1μM+IR。心脏停止灌注45min,随后恢复灌注60min。记录心脏血流动力学指标,包括:心率(heart rate,HR)、左室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)、收缩期左室压力变化率最大值(the highest rate of change of pressure development,+dP/dtmax)、冠脉流出量(coronary flow,CF)。检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量,TTC染色检测心肌梗死面积,TUNEL法检测心肌细胞细胞凋亡率,Western blot法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达。<br>　　2.观察不同浓度姜黄素对心肌细胞模拟缺血再灌注损伤（simulated ischemia reperfusion Injury,SIRI)的影响及其对JAK2/STAT3通路的影响。实验分为:①SIR;②Cur1μM+SIR;③Cur5μM+SIR;④Cur10μM+SIR。Cur处理时间为2h,模拟缺氧2h,复氧4h,检测各组细胞活力、培养液中LDH释放量以及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达。<br>　　3.观察JAK2/STAT3通路阻断剂AG490对姜黄素抗离体心脏IRI作用的影响,同时观察其对线粒体氧化应激指标及凋亡通路分子的影响。实验分为4组:①IR;②Cur+IR;③Cur+AG490+IR;④AG490+IR。心脏灌流稳定后,含有Cur(1μM)的KHB处理心脏5分钟(同时加或不加AG490,1μM),心脏停止灌注45min,随后再灌注60min。记录心脏血流动力学指标LVDP,检测冠脉流出液中LDH释放量、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率。分离提取心肌细胞线粒体,检测线粒体中各项氧化应激指标,包括:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、过氧化氢(H2O2)、氧化还原电位(redox potential,Eh)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)、细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)。Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白表达。<br>　　4.观察JAK2 siRNA阻断JAK2/STAT3通路对姜黄素抗心肌细胞SIRI作用的影响,同时观察其对线粒体氧化应激指标及凋亡通路分子的影响。实验分为4组:①Control siRNA+SIR;②Control siRNA+Cur+SIR;③JAK2 siRNA+Cur+SIR;④JAK2 siRNA+SIR。JAK2 siRNA转染成功后孵育时间为24h,随后Cur(10μM)孵育细胞2h,模拟缺氧2h,复氧4h,检测各组细胞活力、培养液中LDH释放量、心肌细胞凋亡率。分离提取细胞线粒体,检测线粒体氧化应激指标(SOD、MDA、SDH、COX)。Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白表达。<br>　　第二部分:研究SIRT1信号通路是否参与姜黄素抗心肌IRI的保护作用首先观察不同浓度姜黄素抗心肌 IRI过程中对 SIRT1分子影响,初步探明姜黄素心肌保护作用是否与SIRT1通路相关。进一步用SIRT1通路特异性阻断剂Sirinol或者SIRT1 siRNA在离体心脏、在体心脏和心肌细胞水平特异性阻断SIRT1通路,观察其对姜黄素抗心肌 IRI作用的影响,明确姜黄素是否通过调控 SIRT1通路发挥心肌保护作用。<br>　　1.观察SIRT1通路阻断剂Sirtinol对姜黄素抗离体心脏IRI作用的影响,同时观察其对线粒体氧化应激指标及凋亡通路分子的影响。待心脏灌流平稳后,实验分为4组:①IR;②Cur+IR;③Cur+Sirtinol+IR;④Sirtinol+IR。用含有Cur(1μM)的KHB处理心脏5分钟(同时加或不加Sirtinol,3.75μM),心脏停止灌注45min,随后恢复灌注60min。记录心脏血流动力学指标LVDP,检测冠脉流出液中LDH释放量、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率。分离提取心肌细胞线粒体,检测线粒体氧化应激指标(SOD、MDA、H2O2、Eh、SDH、COX)。Western blot检测SIRT1、乙酰化的FOXO1(acetylated-FOXO1,Ac-FOXO1)、Bcl2、Bax蛋白表达。<br>　　2.观察SIRT1 siRNA阻断SIRT1通路对姜黄素抗心肌细胞SIRI作用的影响,同时观察其对线粒体氧化应激指标及凋亡通路分子的影响。实验分为4组:①Control siRNA+SIR;②Control siRNA+Cur+SIR;③SIRT1 siRNA+Cur+SIR;④SIRT1 siRNA+SIR。SIRT1 siRNA转染成功后孵育时间为24h,随后Cur(10μM)孵育细胞2h,模拟缺氧2h,复氧4h,检测各组细胞活力、培养液中LDH释放量、心肌细胞凋亡率。分离提取细胞线粒体,检测线粒体氧化应激指标(SOD、MDA、SDH、COX)。Western blot检测SIRT1、Ac-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白表达。<br>　　3.观察SIRT1通路阻断剂Sirtinol对姜黄素抗在体心脏IRI作用的影响,同时观察其对线粒体氧化应激指标及凋亡通路分子的影响。实验分为4组:①IR;②Cur+IR;③Cur+Sirtinol+IR;④Sirtinol+IR。SD大鼠(220-250g)姜黄素(200mg/kg),术前10天开始灌胃给药;Sirtinol(2mg/kg),腹腔注射,每2天注射1次,共5次;对照组给予生理盐水,每天1次。观察心脏心肌梗死面积、血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)和LDH水平。分离提前细胞线粒体,检测线粒体氧化应激指标(SHD和COX)。Western blot检测SIRT1、Ac-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表达。<br>　　第三部分:研究JAK2/STAT3和SIRT1通路在正常心肌及姜黄素抗心肌IRI中的上下游关系在正常或者姜黄素抗SIRI心肌细胞模型中,分别用JAK2 siRNA、STAT3 siRNA或者SIRT1 siRNA阻断JAK2/STAT3或SIRT1通路,观察其对彼此通路相关分子表达的影响,明确其交互(Cross-talking)或上下游关系。<br>　　研究结果:<br>　　第一部分:研究姜黄素抗心肌IRI作用及JAK2/STAT3信号通路是否参与姜黄素的心肌保护作用1.本部分首先研究了不同浓度姜黄素对IRI心脏是否有保护作用,同时观察了其在该过程中对 JAK2/STAT3通路相关分子表达的影响。离体心脏研究发现不同浓度姜黄素(0.25、0.5、1μM)对IRI离体心脏均有明确的保护作用,表现为改善心脏血流动力学(HR、LVDP、+dP/dtmax和CF)指标(与IR组相比,P<0.01或P<0.05)、降低心肌梗死面积(与 IR组相比,P<0.01)、降低冠脉流出液中 LDH释放量(与IR组相比,P<0.01),还呈浓度依赖性。心肌细胞研究得到了一致的结果,即姜黄素(1、5、10μM)能有效提高SIRI心肌细胞活力(与SIR组相比,P<0.01)、减少培养液中LDH水平(与SIR组相比,P<0.01)。离体心脏和心肌细胞研究还都发现,与IRI组相比,Cur处理能显著提高p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达(与IR组或SIR组相比,P<0.01)。<br>　　2.离体心脏结果进一步发现，1μM 姜黄素显著提高心脏 IRI 后 LVDP、减少心肌梗死面积、减少冠脉流出液中 LDH 释放量、减少心肌细胞凋亡率（与 IR 组相比，所有 P<0.01），AG490 可以逆转姜黄素的保护作用（与 Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。<br>　　姜黄素还可以有效提高 IRI 后心肌线粒体中 SOD、Eh、SDH和COX 水平，显著降低线粒体中 MDA和H2O2 水平（与 IR 组相比，所有 P<0.01），AG490 可以逆转姜黄素抗线粒体氧化应激损伤的作用（与 Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。相关分子检测显示，姜黄素可以显著提高 IRI 后 p-JAK2、p-STAT3 以及抗凋亡蛋白 Bcl2 表达，而降低凋亡相关蛋白 Bax 表达（与 IR 组相比，所有 P<0.01），AG490 可以逆转姜黄素的作用（与 Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。<br>　　3.心肌细胞研究得到了一致的结果。姜黄素处理显著提高心肌细胞 SIRI 后细胞活力、减少培养液中 LDH 水平、减少心肌细胞凋亡率（与 Control siRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01），JAK2 siRNA 可以逆转姜黄素的保护作用（与 Control siRNA+Cur+SIR组相比，所有 P<0.01）。姜黄素还可以有效提高 SIRI 后心肌细胞线粒体中 SOD、SDH和COX 水平，显著降低 MDA 水平（与 Control siRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01），JAK2 siRNA 可以逆转姜黄素抗线粒体氧化应激损伤的作用（与 ControlsiRNA+Cur+SIR 组相比，所有 P<0.01）。相关分子检测显示，姜黄素可以显著提高SIRI 后 p-JAK2、p-STAT3 以及抗凋亡蛋白 Bcl2 表达，而降低凋亡相关蛋白 Bax 表达（与 Control siRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01）JAK2 siRNA 可以逆转姜黄素的作用（与 Control siRNA+Cur+SIR 组相比，所有 P<0.01）。<br>　　第二部分：SIRT1 信号通路参与姜黄素抗心肌 IRI 保护作用的研究1.本部分首先研究了不同浓度姜黄素抗心肌 IRI 过程中对 SIRT1 通路相关分子表达的影响。离体心脏和心肌细胞研究都发现，与 IRI 或 SIRI 组相比，Cur 处理能显著提高 SIRT1 蛋白的表达（P<0.01）。<br>　　2.离体心脏结果进一步发现，姜黄素处理显著提高心脏IRI后 LVDP、减少心肌梗死面积、减少冠脉流出液中 LDH 释放量、减少心肌细胞凋亡率（与IR组相比，所有 P<0.01），Sirtinol 可以逆转姜黄素的保护作用（与 Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。<br>　　姜黄素还可以有效提高IR后心肌线粒体中SOD、Eh、SDH和COX水平，显著降低线粒体中MDA和H2O2水平与IR组相比，所有 P<0.01），Sirtinol 可以逆转姜黄素抗线粒体氧化应激损伤的作用（与Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。相关分子检测显示，姜黄素可以显著提高IRI后SIRT1以及抗凋亡蛋白Bcl2表达，而降低Ac-FOXO1和凋亡相关蛋白Bax表达（与IR组相比，所有P<0.01），Sirtinol 可以逆转姜黄素的作用（与Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。<br>　　3.心肌细胞模型得到了一致的结果。姜黄素处理显著提高心肌细胞 SIRI 后细胞活力、减少培养液中 LDH 水平、减少心肌细胞凋亡率（与 Control siRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01），SIRT1 siRNA 可以逆转姜黄素的保护作用（与 Control siRNA+Cur+SIR组相比，所有 P<0.01）。氧化应激相关指标检测发现，姜黄素可以有效提高 SIRI 后心肌细胞线粒体中SOD、SDH和COX 水平，显著降低MDA水平（与 ControlsiRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01），SIRT1 siRNA 可以逆转姜黄素抗线粒体氧化应激损伤的作用（与 Control siRNA+Cur+SIR 组相比，所有 P<0.01）。相关分子检测显示，姜黄素可以显著提高 SIRI后SIRT1以及抗凋亡蛋白Bcl2表达，而降低Ac-FOXO1和凋亡相关蛋白 Bax 表达（与 Control siRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01），SIRT1 siRNA 可以逆转姜黄素的作用（与Control siRNA+Cur+SIR 组相比，所有P<0.01）。<br>　　4.在体心脏模型研究发现，姜黄素处理显著减少心肌梗死面积、减少血清中 CK和LDH 水平（与 IR 组相比，所有 P<0.01），Sirtinol 可以逆转姜黄素的保护作用（与Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。氧化应激相关指标检测发现，姜黄素可以有效提高IRI 后心肌线粒体中 SDH和COX 水平（与 IR 组相比，所有 P<0.01），Sirtinol 可以逆转姜黄素抗线粒体氧化应激损伤的作用（与 Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。相关分子检测显示，姜黄素可以显著提高 IRI 后 SIRT1 以及抗凋亡蛋白 Bcl2 表达，而降低 Ac-FOXO1和凋亡相关蛋白 Bax 表达（与 IR 组相比，所有 P<0.01），Sirtinol 可以逆转姜黄素的作用（与 Cur+IR 组相比，所有 P<0.01）。<br>　　第三部分：JAK2/STAT3和SIRT1 通路在正常心肌及姜黄素抗心肌 IRI 中的上下游关系1.正常心肌细胞模型研究发现，JAK2 siRNA、STAT3 siRNA和SIRT1 siRNA 对正常心肌细胞活力无显著影响（与 Control siRNA 组相比，所有 P>0.05）。结果还显示，JAK2 siRNA、STAT3 siRNA 不仅可以有效抑制JAK2/STAT3通路（p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 表达下降）（，还能抑制 SIRT1 通路（SIRT1 表达下降，Ac-FOXO1表达上升）与 Control siRNA 组相比，所有P<0.01）。SIRT1 siRNA 可以不仅有效抑制SIRT1通路（SIRT1表达下降，Ac-FOXO1表达上升），还可有效抑制JAK2/STAT3通路（p-JAK2和p-STAT3 表达下降）（与Control siRNA 组相比，所有 P<0.01）。以上结果提示，正常心肌细胞中 JAK2/STAT3 与 SIRT1 通路有交互（Cross-talking）作用，JAK2/STAT3和SIRT1 通路互相影响。<br>　　2.姜黄素抗SIRI心肌细胞模型研究发现，JAK2 siRNA、STAT3 siRNA和SIRT1siRNA 都能逆转姜黄素对心肌细胞的保护作用（与Control siRNA+Cur+SIR 组相比，所有P<0.01），这与研究内容二、三的结果一致。相关分子表达检测发现，姜黄素处理能显著提高 p-JAK2、p-STAT3和SIRT1的表达（与Control siRNA+SIR 组相比，所有 P<0.01）。JAK2 siRNA、STAT3 siRNA 不仅可以逆转姜黄素激活的JAK2/STAT3通路（p-JAK2、p-STAT3 表达下降），还可以逆转姜黄素激活的SIRT1通路（SIRT1表达下降，Ac-FOXO1表达上升）（与Control siRNA+Cur+SIR 组相比，所有P<0.01）。<br>　　而 SIRT1 siRNA不仅能逆转姜黄素激活的SIRT1通路（SIRT1 表达下降，Ac-FOXO1表达上升），还对JAK2/STAT3 通路有显著影响（p-JAK2和p-STAT3的表达下降）<br>　　（与 Control siRNA+Cur+SIR 组相比，所有 P<0.01）。以上结果提示，在姜黄素心肌保护中，JAK2/STAT3和SIRT1-FOXO1 通路相互影响共同介导姜黄素抗心肌 IRI作用。<br>　　研究结论：<br>　　1.姜黄素有明确的抗心肌IRI损伤的作用。<br>　　2.姜黄素通过激活JAK2/STAT3通路，进一步减轻IRI诱发的线粒体氧化应激损伤和细胞凋亡，从而发挥抗心肌 IRI 保护作用。<br>　　3.姜黄素通过激活SIRT1通路，进一步减轻IRI诱发的线粒体氧化应激损伤和细胞凋亡，从而发挥抗心肌 IRI 保护作用。<br>　　4.在姜黄素心肌保护中，JAK2/STAT3和SIRT1-FOXO1 通路有交互（Cross-talking）<br>　　作用共同介导姜黄素抗心肌IRI作用。