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摘要【背景】<br>　　高血压是心血管病(cardiovascular disease,CVD)重要的独立危险因素之一,它导致的心肌肥大并最终转化为心力衰竭严重制约了CVD的临床防治效果。心肌胶原交联度降低是诱导心肌肥大向心力衰竭转化的关键因素,然而对于间质纤维化程度不断增高的肥大心肌,其胶原交联度的变化存在诸多争议,且心肌胶原交联度降低的机制更不是十分清楚。CD147是免疫球蛋白超家族的成员之一,其糖基化程度增加时,可激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP),进而影响胶原交联度。研究表明,CD147与心肌缺血-再灌注损伤、钙化性主动脉瓣狭窄、心力衰竭等多种CVD相关,且血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)能够诱导多种细胞的CD147表达上调、糖基化程度增强。因此,本实验采用肾性高血压诱导心肌肥大,证实糖基化CD147是调节心肌胶原交联度的关键因素,并阐明其可能机制;同时,揭示心肌局部Ang II对CD147的表达量与糖基化程度的调节机制。<br>　　【目的】<br>　　借助肾性高血压引起的慢性压力超负荷与Ang II含量增加诱导的心肌肥大大鼠模型,阐明心肌局部高浓度的Ang II导致CD147的表达与糖基化程度增加,进而激活MMP,促进心肌间质纤维化,同时降低心肌胶原交联度的机制。有望为临床防治高血压导致的心肌肥大向心力衰竭的转化提供理论依据与干预新靶点。<br>　　【方法】<br>　　首先,本实验采用Goldblatt两肾一夹(two-kidney one-clip,2K1C)大鼠模型模拟肾性高血压导致的心肌肥大,通过生理学、形态学、生物学、生物化学、医学影像学等多重指标对2K1C大鼠进行系统性评估,运用Western blot与植物凝血素植物血球凝集素-L(phytohemagglutinin-L,PHA-L)染色检测肥大心肌不同时期 CD147的表达与糖基化水平。<br>　　然后,给予模型动物 CD147的糖基化酶β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(β1,6-N-acetylglucosaminyl transferase-V,GnT-V)的抑制剂衣霉素或活化剂维甲酸,运用Western blot、免疫荧光组织化学与植物凝血素PHA-L染色检测心肌CD147的表达与糖基化水平,采用明胶酶谱测定MMP-2和-9的活性,Masson染色及羟基脯氨酸含量测定观察心肌间质纤维化程度与胶原含量,并检测心肌胶原交联度的变化。<br>　　最后,给予模型动物1型血管紧张素受体(angiotensin receptor type1,AT1)拮抗剂氯沙坦,依然检测心肌CD147的表达与糖基化水平。进一步分离并培养新生大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocyte,NRCM),Ang II、氯沙坦、2型血管紧张素受体(angiotensin receptor type2,AT2)拮抗剂PD123319、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂十字孢碱、PKC活化剂12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐（phorbol12-myristate13-acetate,PMA)、衣霉素或维甲酸处理后,检测NRCM CD147的表达与糖基化水平。<br>　　【结果】<br>　　(1)2K1C大鼠心肌CD147表达与糖基化进行性升高<br>　　2K1C大鼠的心脏结构与功能呈现时间依赖性改变。颈动脉插管测量血压显示,2K1C大鼠血压呈进行性升高,术后1 w血压即明显升高,8 w时收缩压(systolic blood preasure,SBP)已经超过200 mmHg。ELISA结果提示,2K1C大鼠血浆Ang II浓度在术后1 w即达到峰值,并维持在较高水平;同样,心肌Ang II浓度在达到峰值后始终维持在较高水平。在系统性评价心脏结构与功能时选用了多重指标进行全面分析。首先,运用ELISA检测心肌肥大标志物心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),结果表明,2K1C大鼠术后心肌组织ANP浓度始终维持在较高水平。其次,由大体观察与心脏四腔切面可见,2K1C大鼠术后4 w开始出现心脏增大、室间隔和心室壁明显增厚、心腔缩小等特征,且生物学测量进一步证实了这一结果。另外,左心室、右心室的心室重量/心脏重量(ventricle weight/heart weight,VW/HW)均无统计学差异。不仅如此,组织病理学检查提示,2K1C大鼠4 w后心肌纤维增粗,统计结果显示单个心肌细胞直径明显增大。再次,超声心动图检查提示,表征心脏舒张功能的左心室缩短率(fractional shortening,FS)和收缩功能的左心室射血分数(ejection fraction,EF)稍有降低,但并未达到心力衰竭的标准。与此同时,2K1C大鼠与Sham大鼠的肺脏重量/体重(lung weight/body weight,LungW/BW)、肝脏重量/体重(liver weight/body weight,LiverW/BW)、肺脏与肝脏干重/湿重(dry weight/wet weight,Wd/Ww)均无统计学差异。最后,Masson染色及羟基脯氨酸含量测定表明,与Sham大鼠相比,2K1C大鼠心肌间质纤维化逐渐增强,心肌胶原含量呈进行性增加。另外,大体观察及生物学测量显示,2K1C导致肾动脉缩窄侧肾脏术后体积与重量逐渐减小,左肾重量/右肾重量(left kidney weight/right kidney weight,LKW/RKW)逐渐降低,即2K1C导致肾动脉缩窄侧肾脏术后逐渐萎缩,这也是2K1C模型的标准之一。<br>　　2K1C大鼠心肌 CD147的表达量进行性升高,其糖基化水平也逐渐增强。由于2K1C大鼠血压、心肌肥大程度、间质纤维化水平及 CD147表达量均呈现进行性改变趋势,因此采用Pearson相关分析评估CD147表达量与血压、心肌肥大及间质纤维化程度之间的关系。结果表明,CD147表达水平与血压、心肌肥大及间质纤维化程度均呈正相关。而进一步的受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)分析则证实了CD147表达量可能具备一定的诊断能力。ROC分析显示,CD147表达量能够诊断高血压、心肌肥大及间质纤维化。<br>　　(2)糖基化CD147参与调节心肌胶原交联度<br>　　从整体来看,本实验中使用的GnT-V抑制剂衣霉素或活化剂维甲酸对2K1C大鼠的血压和心肌组织Ang II浓度并无明显影响。对心脏而言,衣霉素或维甲酸处理的Sham大鼠的心脏大小并无明显改变,但衣霉素处理的2K1C大鼠心脏缩小,而维甲酸处理的心脏增大。进一步的生物学测量表明,由于衣霉素明显降低大鼠BW,衣霉素处理的Sham与2K1C大鼠心脏重量/体重(heart weight/body weight,HW/BW)显著升高,且高于相应的Sham或2K1C大鼠,造成心肌肥大的假象。超声心动图检查提示,维甲酸降低2K1C大鼠的左心室EF值。Western blot结果显示,衣霉素使2K1C大鼠心肌 CD147表达降低,而维甲酸则使其增加。同样,免疫荧光组织化学染色显示,衣霉素使2K1C大鼠心肌CD147在心肌细胞膜上的分布减少,而维甲酸则使其增加。进一步的植物凝集素PHA-L染色提示,衣霉素使Sham及2K1C大鼠心肌糖基化程度减弱,而维甲酸使其糖基化程度增强。于是,我们进一步检测心肌胶原交联度,结果发现,衣霉素对2K1C大鼠心肌胶原交联度并无明显影响,而维甲酸则使其下降。<br>　　明胶酶谱结果显示,2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性增强,给予衣霉素后,2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性均下降,相反,给予维甲酸时,Sham与2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性升高。<br>　　(3)Ang II经AT1、PKC、GnT-V促进CD147糖基化<br>　　给予氯沙坦后,血压测量、ELISA、大体观察与生物测量提示,氯沙坦能有效降低2K1C大鼠的血压、延缓心肌肥大。Western blot与免疫荧光组织化学结果显示,氯沙坦可降低2K1C大鼠心肌CD147的表达,进一步的植物凝集素PHA-L染色提示,给予氯沙坦能够减弱2K1C大鼠心肌细胞膜上的糖基化程度。离体实验结果表明,AT1拮抗剂氯沙坦、PKC抑制剂十字孢碱、GnT-V抑制剂衣霉素可降低Ang II处理的NRCM CD147的表达水平及糖基化程度,AT2拮抗剂PD123319对两者均无影响,而PKC活化剂PMA与GnT-V活化剂维甲酸可增加NRCM CD147的表达水平及糖基化程度。<br>　　【结论】<br>　　本实验初步阐释了糖基化 CD147参与调节心肌胶原交联度,其可能的机制是Ang II诱导CD147表达与糖基化程度增加,进而激活MMP,促进心肌间质纤维化,同时降低心肌胶原交联度。以上研究为探寻心力衰竭的发病机制提供了全新的见解,CD147有望成为心肌保护的潜在靶点,为CVD的临床防治提供全新策略。