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摘要研究意义:<br>　　压力后负荷导致的心肌肥厚是心力衰竭病理过程中至关重要的环节。许多的机制试着来阐明这种压力负荷导致心肌结构的改变,其中一种就是体液因子如血管紧张素II、肾上素等的释放促进心肌肥厚的发生。而这些体液因子发挥促肥厚作用主要是通过Gq和Gs蛋白偶联受体介导的。组胺及其受体在心血管中广泛分布,但是有关心脏局部组胺的来源,以及组胺与其它传统导致心肌肥厚的因素的关系一直未见报道。<br>　　本课题采用主动脉缩窄术(TAC术)致心肌肥厚模型,引进组氨酸脱羧酶基因敲除的小鼠,从整体动物到单个细胞水平,证实组胺是否参与心肌肥厚的病理过程,并探讨介导组胺作用的受体以及机制。为进一步的深入研究心肌肥厚的致病机制,为临床治疗心肌肥厚提供新的药物靶点。<br>　　目的:<br>　　1)明确组胺及其组胺H2受体参与心肌肥厚的作用。<br>　　2)探讨激动组胺H2受体促心肌肥厚的作用的分子学机制。<br>　　方法:<br>　　1)主动脉弓缩窄术与腹腔注射药物的方法建立心肌肥厚的动物模型。<br>　　2)原代心肌细胞培养的方法建立体外细胞实验模型。<br>　　3)药理学的方法给予组胺H2受体的拮抗剂法莫替丁与阻滞dimaprit。<br>　　4)ELISA的方法检测心肌组织与血浆中组胺的含量。<br>　　5)细胞免疫荧光的方法检测心肌细胞中特异性蛋白a-actinin。<br>　　6)westernblot的方法检测目标蛋白的表达变化。<br>　　7)应用膜片钳技术检测ⅠCa-L开放的情况。<br>　　8)Real-TimePCR检测心肌肥厚相关标志物的mRNA的表达情况。<br>　　9)HE染色检测心肌组织形态学改变。<br>　　10)采用小动物超观察小鼠心脏功能指标。<br>　　结果:<br>　　1)观察其致心肌肥厚模型建立是否成功。TAC术后4周进行小动物M型超声观察,与sham组相比,TAC术组的小鼠左心室射血分数(EF％)和短轴缩短率(Fs%)均明显的降低(P<0.01),心体比、心肌细胞横截面积以及ANP、BNP均显著升高(P<0.01),说明心肌肥厚模型建立成功。TAC术后2W、4W用小鼠组胺 ELISA试剂盒检测心肌组织与血浆中组胺的含量,发现组胺含量增加且存在一定的时间-效应关系,在4W时,与sham组相比,血浆与心肌组织中组胺的含量分别增加了46.7%、54.2%,这些数据提示了组胺可能参与了压力后负荷诱导的心肌肥厚的病理生理过程,为了证实这一点,我们引进组氨酸脱羧酶基因敲出的小鼠,在TAC术后4W,与野生型小鼠相比,发现心肌肥厚指标:心体比、心肌细胞横截面积和ANP、BNP的表达量均显著降低(P<0.01),而心功能指标射血分数与短轴缩短率显著上调(P<0.01)。这些结果证实组胺参与压力后负荷导致的心肌肥厚的病理生理过程。<br>　　2) western-blot检测TAC术4W后组胺H1、H2受体的表达量的变化,与sham组相比,组胺H2受体的表达量明显上调(P<0.01),而组胺H1受体的表达量变化没有统计学意义。而上述结果提示组胺可能是通过激活心肌组织上的组胺H2受体来参与心肌肥厚的病理过程。为了证实上面的结论,我们采用药理学研究方法,观察组胺H2受体的激动剂与拮抗剂与对心肌肥厚病理生理的影响。通过应用组胺H2受体特异性激动剂dimaprit作用于整体动物的心肌组织与离体心肌细胞,直接观察组胺H2受体是否参与心肌肥厚的病理过程。本实验发现:给予C57小鼠dimaprit干预,导致小鼠心体比、心肌细胞横截面积与心肌肥厚相关标志性基因表达量明显增高(P<0.01),同时通过小鼠M型超声检测发现心功能指标左室射血分数与左室短轴缩短率均明显降低(P<0.01);给予C57小鼠乳鼠提取的原代心肌细胞dimaprit进行干预,导致心肌细胞横截面积、心肌肥厚相关标志性基因表达量显著增加(P<0.01)。且这与dimaprit之间存在一定的剂量-效应关系,进一步提示了激动组胺 H2受体参与心肌肥厚的病理过程。另一方面,建立 TAC心肌肥厚模型,给予组胺 H2受体拮抗剂 famotidine,检测发现 famotidine可以导致TAC术后4W小鼠心体比、心肌细胞横截面积、ANP的mRNA的表达量均显著降低(P<0.01),并且改善心功能指标左心室射血分数与左心室端州缩短率等(P<0.01),这些证据在提示famotidine有延缓TAC术导致心肌肥厚的病理进程效应,并且famotidine剂量与心肌肥厚的程度呈负相关,进一步提示组胺H2受体拮抗剂可以延缓心肌肥厚的病理生理过程。以上两个实验证实了组胺可能参与心肌肥厚的病理生理过程。<br>　　3)将原代心肌细胞分成 control组、isoprenaline组、histamine组、dimaprit组、famotidine组以及dimaprit与famotidine共同用药组,给予各种处理48h,dimaprit与histamine可以显著提高磷酸化的PKA与CaMKⅡ的表达量(P<0.01),且给予famotidine又可以阻滞dimaprit导致的磷酸化的PKA与CaMKⅡ的上调(P<0.01)。而对于Epac1、Epac2没有任何统计学上的改变。这些结果提示激动组胺H2受体后,通过第二信使PKA的活化,钙离子的积累最终介导CaMKⅡ诱发心肌肥厚的发生。细胞内Ca2+浓度升高是诱发心肌肥厚、心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病的病理生理的中心环节。肌质网ryanodine内钙释放是导致心肌细胞内钙浓度升高的主要来源,而L型钙通道开放是调控肌质网ryanodine受体的主要因素,L型钙通道的密度越大,其诱发的心肌肥厚的程度会越大。我们研究发现,组胺H2受体激动剂dimaprit可以促进L型钙通道的开放,使L型钙通道的数目增加,进而引发细胞内的钙超载,而famotidine可以抑制dimaprit诱发的L型钙通道的开放,缓解心肌细胞内钙超载引发的心肌肥厚。这说明激动组胺H2受体可以诱导 L型钙通道的开放。综上所示,组胺H2受体激活后,可能是通过PKA-Ca2+-CaMKⅡ信号通路轴来介导心肌肥厚的发生。<br>　　结论:<br>　　1)组胺及其H2受体参与了心肌肥厚的病理过程。<br>　　2)组胺H2受体激动后,通过经典的Gs-pka-Ca2+通路导致心肌肥厚。