检索历史 清除

摘要旋毛虫病是一种由旋毛虫感染引起的食源性人兽共患寄生虫病,可以感染人和多种哺乳动物。人类主要因生食或半生食含有幼虫囊包的猪肉而感染。随着人们饮食习惯的改变,野生动物和马肉成为人旋毛虫病的新感染源。世界上许多国家都有该病爆发的报道,该病对动物养殖和食品安全都产生了较大影响。因此,研制抗旋毛虫病的疫苗具有较大的经济价值。<br>　　预防寄生虫感染的常用方法是利用其天然抗原或重组蛋白抗原对宿主进行免疫,宿主体内产生相应的抗体进而起到保护作用。利用动物实验的方法,已有旋毛虫虫体提取物、ES产物及其它重组蛋白疫苗研究的报道。如p43、p53核酸疫苗,经动物实验证实,该疫苗对宿主具有一定的免疫保护作用。但是旋毛虫抗原成分非常复杂,并且不同发育期具有特异性,已经研制出的核酸疫苗保护作用一般,我们应该积极寻找更加有效的抗原基因。<br>　　从本实验室已构建的旋毛虫感染动物模型中,利用人工消化法收集肌幼虫,利用RT-PCR的方法克隆一个新的旋毛虫肌幼虫基因。测序结果与已发表的基因序列比对,结果证实二者来自同一基因。再利用原核表达、蛋白纯化、Western Blot的方法,获得重组蛋白,结果证实该蛋白具有抗原性,为疫苗的研制打下理论基础。<br>　　目的:<br>　　克隆一个新的旋毛虫肌幼虫基因即亲肌肉抗原(Myophilin),并分析其序列同源性。然后进行原核表达,并对表达出的蛋白利用Western Blot的方法分析其免疫学特性,为旋毛虫病疫苗的研制提供理论基础。<br>　　方法:<br>　　在GenBank旋毛虫基因组数据库中进行检索,获得旋毛虫亲肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0软件设计引物(上下游引物分别含NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点)。收集云南株旋毛虫肌幼虫,提取总RNA,并以此为模板进行RT-PCR。将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收后与克隆载体 pMD-19T分别用 NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物以3:1连接,然后转化到DH5a大肠杆菌感受态细胞中,Amp抗性培养基培养。阳性克隆提质粒后做 PCR及双酶切鉴定,阳性菌液进行测序,测序结果与检索基因核苷酸序列通过DNAMAN软件比较,分析其同源性。测序结果完全正确后构建原核表达重组体pET22b-Myophilin,转化到BL21中,阳性菌液鉴定成功后IPTG诱导大肠杆菌内表达,His-tag标签纯化蛋白,经SDS-PAGE鉴定重组蛋白及纯化蛋白。用Western blot对该蛋白的免疫原性进行检测。<br>　　结果:<br>　　1亲肌肉抗原的RT-PCR扩增:2%琼脂糖凝胶电泳显示,RT-PCR扩增得到1条约579bp的条带,与预期大小相符,表明成功扩增出目的基因Myophilin。<br>　　2重组克隆质粒的PCR及酶切鉴定:以重组质粒为模板,经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到1条与目的片段大小一致的条带,确认目的基因克隆成功。重组质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,获得大小分别为2600bp、579bp和300bp左右的3条带,与预期结果相符,再次验证目的基因克隆成功。<br>　　3亲肌肉抗原序列测定及其同源性分析:所测亲肌肉抗原基因序列与NCBI数据库进行BLAST,同源性为100%。<br>　　4重组表达载体的构建及鉴定:表达载体pET22b利用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,将目的基因与表达载体的连接产物提质粒,做质粒 PCR得到一条579bp的条带,双酶切获得大小分别为5500bp和579bp的2条带,与理想结果相符,证明连接成功。<br>　　5重组蛋白的纯化鉴定:重组蛋白经6*His标签的镍柱亲和层析纯化后得到一条蛋白条带,分子量约21kDa。<br>　　6 Western Blot鉴定免疫特性:将纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳转印,以感染40天旋毛虫小鼠的血清为一抗进行Western Blot,显色时在21kDa处有条带,说明Myophilin具有抗原性。<br>　　结论:<br>　　1成功提取出旋毛虫肌幼虫总RNA,克隆出Myophilin基因。<br>　　2构建了Myophilin基因的原核表达载体重组体。<br>　　3诱导表达出Myophilin蛋白,并成功纯化。<br>　　4 Western Blot的方法验证了亲肌肉抗原的抗原性。