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摘要一.背景:<br>　　非吻合口胆管狭窄(nonanastomotic biliary strictures,NABS)是目前肝移植术后胆道并发症的主要类型,可导致进行性胆汁性肝硬化、移植物失功、再次肝移植及死亡,是制约肝移植疗效进一步提高的瓶颈。其病理基础是胆管上皮细胞(biliary epithelial cell,BEC)损伤后局部异常修复所致的移植肝胆管纤维化。研究发现,移植肝胆管纤维化发生的独立影响因素是冷保存再灌注损伤(cold preservation reperfusion injury,CPRI),但其发病机制有待进一步阐明。<br>　　既往有关CPRI致移植肝胆管纤维化机制的研究主要侧重于TGF-1诱导的肝星形细胞活化这一固有途径。新近研究证实,BEC在细胞因子/促炎因子刺激下可通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)为成纤维细胞,是肝胆道纤维化过程中基质生成细胞的主要异质性来源。我们前期研究发现,BEC EMT是肝移植术后胆道纤维化狭窄的重要因素,提示若在BEC EMT这一关键环节进行干预,有可能抑制或逆转移植肝胆管纤维化的进程。<br>　　上皮-间质转化/间质-上皮转化(epithelial-mesenchymal transition/mesenchymal-epithelial transition,EMT/MET)的平衡决定了创伤、炎症组织修复的转归和结局,如果EMT发挥主要作用,修复将以纤维化告终,反之,纤维化可逆转为正常上皮。因此,通过抑制EMT、促进MET来减轻或逆转创伤、炎症组织的纤维化,已成为抗纤维化研究新的靶点。发鼻指(趾)综合征1型相关基因(trichorhinophalangeal syndrome type1,Trps1)是胚胎期间充质细胞向上皮细胞转分化的重要调控因子,对多种细胞EMT起关键的负向调控作用,而创伤、炎症组织的修复过程是胚胎期多种上皮组织发育过程的再现。文献报道Trps1在负向调控肾小管上皮细胞、肺泡上皮细胞EMT及肾脏、肺纤维化中发挥关键作用,但其是否参与了移植肝胆管CPRI损伤后修复过程及其可能的机制目前尚不清楚。<br>　　二.目的:<br>　　通过检测肝移植术后NABS患者病肝标本,离体和在体动物实验证实Trps1参与肝移植术后NABS发生,通过对BEC EMT过程的关键负向调控作用,进而抑制移植肝胆管纤维化的进程。本研究有望拓宽对移植肝胆管纤维化发生机制的认识,为临床肝移植术后NABS的防治提供新的策略,也将为损伤性胆管狭窄、肝胆管结石病等相关疾病的理论研究和临床诊治提供新的线索。<br>　　三.方法和结果:<br>　　第一部分:NABS病肝标本中Trps1、上皮及间质标志物表达<br>　　采集肝移植术后NABS患者二次肝移植病肝标本6例,免疫组化方法检测Trps1及上皮标志物(E-cadherin、CK19)、间质标志物(Vimentin、α-SMA)蛋白在BEC中的表达;Masson三色染色检测胆管周围胶原沉积。免疫组化及Masson染色结果均进行半定量分析。用肝脏海绵状血管瘤瘤体周边正常肝胆管组织进行对照。采用直线回归分析评估:(1)移植肝胆管Trps1与上皮标志物(E-cadherin、CK19)、间质标志物(Vimentin、α-SMA)表达水平相关性;(2)移植肝胆管纤维化程度与Trps1蛋白表达水平的相关性。<br>　　NABS组标本中BEC Trps1、上皮标志物(E-cadherin、CK19)表达下调或缺失,间质标志物(Vimentin、α-SMA)异常阳性表达,胆管周围大量胶原沉积;而对照组中上BEC Trps1、上皮标志物(E-cadherin、CK19)正常表达,间质标志物(Vimentin、α-SMA)阴性,胆管周围仅见少量胶原沉积。免疫组织化学半定量分析显示上述各种标志物在两组中的表达水平差异显著(P<0.05)。Mssson染色结果半定量分析显示两组标本胆管周围胶原沉积水平差异显著(P<0.05)。直线回归分析显示,Trps1与上皮标志物(E-cadherin、CK19)表达正相关(P<0.05),而与间质标志物(Vimentin、α-SMA)表达负相关(P<0.05)。移植肝胆管纤维化程度与Trps1表达水平负相关(P<0.05)。<br>　　第二部分:离体实验:Trps1在体外模拟CPRI诱导培养的HIBEC EMT中的作用<br>　　采用体外模拟 CPRI的方法处理人肝内胆管上皮细胞(human intrahepatic biliary epithelial cells,HIBECs P5100),电镜下观察细胞形态,划痕试验比较细胞运动能力, PCR检测Trps1、上皮标志物(E-cadherin、CK19)与间质标志物(Vimentin、α-SMA) mRNA表达水平并做相关分析,Western blotting检测上述标志物蛋白表达水平。分别利用Trps1腺病毒及Trps1 siRNA转染HIBEC上调或下调内源性Trps1表达,重复CPRI诱导实验,PCR及Western blotting检测上皮标志物E-cadherin、间质标志物Vimentin mRNA及蛋白表达水平。<br>　　体外模拟CPRI处理HIBEC后,细胞形态由卵圆石样或多边形变为梭形居多的成纤维细胞样,细胞运动能力明显增强(P<0.05)。上皮标志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表达减少(P<0.05),而间质标志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表达增加(P<0.05),BEC发生EMT。直线回归分析显示在此过程中Trps1 mRNA与上皮标志物(E-cadherin、CK19)mRNA表达正相关(P<0.05),而与间质标志物(Vimentin、α-SMA)mRNA表达负相关(P<0.05)。Trps1腺病毒转染HIBEC后,细胞内Trps1 mRNA表达升高,重复上述CPRI诱导实验,上皮标志物E-cadherin mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而间质标志物Vimentin mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),EMT效应被抑制; Trps1 siRNA转染HIBEC后,细胞内Trps1 mRNA表达降低,重复上述CPRI诱导实验,上皮标志物E-cadherin mRNA及蛋白表达水平进一步降低(P<0.05),而间质标志物Vimentin mRNA及蛋白表达水平进一步升高(P<0.05),EMT效应加强。<br>　　第三部分:在体实验:Trps1在SD大鼠原位肝移植术后胆管细胞EMT中的作用<br>　　建立重建肝动脉血供的SD大鼠原位肝移植模型,冷保存时间选择1h、6h、12h,术后选择1d、3d、7d、14d四个时相点,采用Real-Time PCR定量检测大鼠移植肝胆管Trps1、上皮标志物(E-cadherin、CK19)与间质标志物(Vimentin、α-SMA)mRNA表达水平,Western blotting检测Trps1、上皮标志物E-cadherin、间质标志物Vimentin蛋白表达水平。<br>　　随着供体肝脏冷保存时间延长,Trps1 mRNA及蛋白表达逐渐降低(P<0.05),上皮标志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表达逐渐降低(P<0.05)、间质标志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表达逐渐升高(P<0.05)。随着术后时间延长,移植肝胆管上皮标志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表达逐渐降低(P<0.05),间质标志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表达逐渐升高(P<0.05)。而Trps1表达先下调后上调,表现为术后1d Trps1 mRNA及蛋白表达降低,3d开始升高,至14d达到峰值。<br>　　四.结论:<br>　　1.Trps1参与肝移植术后NABS发病过程,并与BEC EMT及移植肝胆管纤维化负相关。<br>　　2.体外模拟CPRI可诱导HIBEC发生EMT,Trps1参与调控HIBEC EMT,发挥重要的拮抗作用并可能逆转该过程。<br>　　3.SD大鼠肝移植术后,CPRI引起Trps1表达下调,进而诱导BEC发生EMT,在动物疾病模型上进一步证实Trps1是BEC EMT的关键负向调控因子。<br>　　4.SD大鼠肝移植术后,Trps1表达与BEC EMT负相关,但Trps1表达变化与EMT进程不完全一致,提示其可能具有抑制移植肝胆管纤维化,促进其修复的作用。