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摘要背景与目的:<br>　　肠粘膜屏障是机体抵御外界病原侵袭的重要屏障结构,包括机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障。肠黏膜机械屏障是由不断的更新的上皮细胞以及细胞之间的紧密连接构成的物理屏障,将上皮下的组织和肠道菌群隔离开,防止细菌的侵袭及随后引起的炎症,因此机械屏障是肠粘膜屏障结构的基础。上皮细胞快速的更新,替代脱落的肠上皮细胞,维持着肠上皮屏障的完整性[1]。肠黏膜具有独特的解剖结构,从血管、上皮下组织、肠粘膜上皮细胞到肠腔形成了明显的由高到低的氧浓度梯度[2]。炎症性肠病(IBD)、全胃肠外营养(TPN)、缺血再灌注(I/R)、烧伤、战创伤和手术应激等病理条件下,均可引起肠黏膜局部缺血缺氧,进而破坏紧密连接蛋白及释放大量炎性因子,导致肠道通透性增加,内毒素入血及细菌移位(bacteria translocation,BT),进而引起全身炎症反应综合征(SIRS),并最终诱发多脏器功能衰竭(MODS),甚至导致患者死亡[3]。<br>　　沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC),在维持稳态以及细胞生存中起关键作用[4]。SIRT1是第III类组蛋白去乙酰化酶sirtuin蛋白家族中的一员[5]。位于细胞核中的SIRT1蛋白是研究的最多的去乙酰化酶,负性调节损伤反应的转录因子和p53,从而促进细胞在压力下生存[6][7][8]。研究发现,缺血缺氧等应急情况下,SIRT1的激动剂Resveratrol的预处理可使心脏、脑及肾脏等组织器官损伤减轻[9][10][11]。大量研究证明,SIRT1在慢性炎症性损伤过程中,通过减少炎性因子的释放,以及抑制炎性因子介导的细胞毒性反应,发挥着保护作用[1][2][3]。Singh等[4]发现,在葡聚糖硫酸钠诱发的小鼠结肠炎模型中,Resveratrol可以降低IL-6和IL-1β等炎症因子表达,减轻炎症对肠黏膜造成的损伤。<br>　　对于SIRT1的在急、慢性病理条件中如何参与调控肠粘膜屏障功能的研究,目前仍不明确。因此,本课题拟建立体外肠上皮屏障模型,应用RT-PCR、蛋白印迹、免疫荧光、跨上皮电阻测定等技术,探讨缺氧条件以及TNF-α条件下SIRT1的激活对维持肠上皮屏障功能关键的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表达及结构的变化。并通过跨上皮电阻技术测定跨上皮电阻(TER),明确缺氧条件下SIRT1的激活对肠上皮屏障的调控机制,为肠上皮屏障损伤及修复机制研究的提供新思路。<br>　　方法:<br>　　1.体外建立肠上皮细胞缺氧模型及SIRT1激动剂Resveratrol处理模型,通过跨上皮电阻(TER)测定技术,了解缺氧及Resveratrol(SIRT1激动剂)干预情况下TER的变化情况。通过蛋白印迹、RT-PCR、免疫荧光,检测常氧、缺氧及缺氧条件下Resveratrol干预对肠上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表达以及结构的影响。<br>　　2.在上述细胞模型中,通过蛋白印迹WB技术检测NF-κB在各实验组的表达变化,探讨SIRT1在缺氧条件下肠上皮屏障功能调节可能的作用机制及信号通路。<br>　　3.模型建立肠上皮细胞系Caco-2 TNF-α处理及SIRT1激动剂Resveratrol干预模型,通过transwell小室培养肠上皮细胞、TER测定技术,了解TNF-α处理及Resveratrol(SIRT1激动剂)干预情况下TER的变化情况。通过蛋白印迹、免疫荧光,检测对照、TNF-α处理及TNF-α处理+Resveratrol干预对肠上皮Occludin、ZO-1表达以及结构的影响。<br>　　主要结果:<br>　　1.单纯缺氧可以导致体外培养肠上皮Caco-2细胞SIRT1表达量减少;缺氧引起紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA及蛋白表达水平下降,并且紧密连接结构破坏,同时上皮细胞TER明显降低;而SIRT1激动剂Resveratrol缓解了缺氧条件引起的肠上皮屏障功能损害,肠上皮细胞紧密连接蛋白表达增多,且促进跨上皮电阻TER恢复。<br>　　2.缺氧6h后,Caco-2肠上皮细胞质内的p-IκB表达与对照组相比明显增加,而I-κB则减少;细胞质内的p65表达明显降低,同时细胞核内的p65表达明显增加。这表明p65从细胞质转移到了细胞核,是NF-κB活化的表现,而SIRT1被Resveratrol激活后则能明显抑制这一活化作用。<br>　　3.TNF-α处理可以导致体外培养肠上皮Caco-2细胞SIRT1表达量减少;TNF-α处理引起紧密连接蛋白Occludin和ZO-1蛋白表达水平下降,并且紧密连接结构破坏,同时上皮细胞TER明显降低;而SIRT1激动剂Resveratrol预处理缓解了TNF-α处理引起的肠上皮屏障功能损害,肠上皮细胞的紧密连接蛋白表达增多,且促进了跨上皮电阻恢复。<br>　　结论:<br>　　1.缺氧及TNF-α处理条件下肠上皮SIRT1表达明显降低,TJs表达降低,结构破坏,同时造成肠上皮细胞 TER降低。而Resveratrol的预处理则可缓解这一作用。提示缺氧及TNF-α处理条件下可通过SIRT1调控肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达及分布来影响肠上皮屏障功能。<br>　　2.缺氧时诱导的NF-κB的激活,而SIRT1的激动剂Resveratrol预处理可抑制缺氧时NF-κB的激活。表明,SIRT1通过NF-κB通路在缺氧诱导的肠上皮屏障损伤中发挥了重要作用。