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摘要研究背景：<br>　　年龄相关性白内障(Age-related cataract, ARC)是全球最主要致盲眼病之一[1],其主要临床表现为晶状体发生混浊,且患者随着年龄增长发生无痛性视力下降。随着人口快速增长和老龄化,ARC患者数量将日趋增加[2];虽然白内障超声乳化手术能给患者带来较满意视力效果,但不可避免的存在一些术后并发症;同时日益增长手术需求加重了社会经济问题,其巨额支出给国家及社会带来了沉重的医疗经济负担。目前研究认为ARC为典型的多基因疾病,其发生发展与环境及遗传等多种因素相关[3]。<br>　　真核细胞胞浆中的RNA颗粒被定义为由不同功能mRNA与蛋白质组成的一种亚细胞单位复合体,其在转录后的基因表达调控中起着十分重要的作用[4]。最新研究表明,RNA颗粒成分的TDRD7(Tudor domain containing protein7,TDRD7)基因与白内障的发病机制密切相关,且 TDRD7突变会导致众多已知与白内障相关的基因表达发生明显变化。其中与白内障发病机制相关的已知βB3晶状体蛋白(βB3-crystallin, CRYBB3)与小分子热休克蛋白1(small Heat shock protein1,HSPB1)可直接与TDRD7相结合。RNA颗粒成分 TDRD7对维持晶状体透明功能发挥着重要作用[5],但 TDRD7与ARC的遗传易感性及其在晶状体功能中作用具体机制尚未见文献报道。<br>　　研究目的：<br>　　采取功能候选基因策略在中国汉族人群中对TDRD7基因单核苷酸多态性与ARC易感性进行关联研究,并对ARC易感位点的功能机制进行初步探讨;同时对TDRD7介导的HSPB1/CRYBB3信号通路影响ARC发生的分子机制进行初步研究。<br>　　研究方法：<br>　　1.利用HAPMAP数据库,结合生物信息学方法挑选具有潜在生物学效应的TDRD7单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点。<br>　　2.按照统一的纳入排除标准收集ARC患者及健康自愿者的外周静脉血,抽提基因组DNA;采用SNaPshot方法进行基因分型,分析TDRD7基因单核苷酸多态性在ARC患者及对照组之间基因型、等位基因频率,以及与不同类型不同年龄阶段的 ARC发生风险的相关性。<br>　　3.利用免疫组织化学方法观察人类晶状体TDRD7和HSPB1蛋白表达及定位;利用实时荧光定量 PCR方法在 RNA水平上对不同年龄不同基因型的皮质性 ARC患者晶状体上皮组织TDRD7、HSPB1和CRYBB3表达情况进行探讨。同时采用Western Blot方法在蛋白水平上观察不同年龄不同基因型的皮质性 ARC患者晶状体上皮组织HSPB1和CRYBB3表达变化。<br>　　研究结果:<br>　　1.利用HAPMAP数据库结合生物信息学分析在TDRD7基因及其上游7kb调控区域内筛选出5个最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)大于10％的SNP位点作为研究对象。这5个位点分别为位于外显子诱发错义突变的 rs2045732及位于TDRD7上游调控区个的4个SNP位点(rs1462091,rs11793735,rs10981985,rs1462089)。<br>　　2.在符合纳入排除标准的271例正常健康对照和218例ARC病例中,采用SNaPshot方法对筛选出的5个位点进行基因分型,5个位点在病例及对照中均符合哈温平衡。分析显性、隐性、等位基因遗传模式下各个SNP位点与ARC发生风险相关性,结果提示 rs10981985位点多态性与 ARC发病风险显著相关。其中 rs10981985A等位基因显著减低ARC发生风险(pc=0.01,OR:0.619,95%CI:0.455-0.841),且GA和AA基因型个体 ARC患病率显著低于 GG基因型个体(pc=0.02,OR:0.561,95%CI:0.388-0.809)。而其余4个位点与ARC发生风险均无显著性差异(pc>0.05)。<br>　　3.其次在不同类型白内障患者中发现,rs10981985位点多态性与皮质性ARC发病风险相关程度更高,即 A等位基因降低皮质性 ARC发生风险(pc=0.012,OR:0.502,95%CI:0.315-0.801),GA和AA基因型个体皮质性ARC发生率显著低于GG基因型个体(pc=0.016,OR:0.431,95%CI:0.251-0.740);此外rs10981985GA和AA基因型个体混合性ARC患病率低于GG基因型个体(pc=0.048,OR:0.433,95%CI:0.235-0.797)。<br>　　4.以不同年龄层次将样本划分为<65岁及≥65岁两组,观察在显性、隐性、等位基因遗传模式下rs10981985位点单核苷酸多态性与ARC患病风险相关性,结果提示在≥65岁组人群中rs10981985单核苷酸多态性与ARC发病风险显著相关,其中在≥65岁组人群中 A等位基因显著减低 ARC发生风险(pc=0.004, OR:0.476,95%CI:0.299-0.759),且 AA基因型个体在≥65岁组人群中 ARC患病风险显著低于 GG和GA基因型携带个体(pc=0.016,OR:0.086,95%CI:0.011-0.671)。<br>　　5.将皮质性ARC患者以不同年龄层次将样本划分为<65岁及≥65岁两组,观察在显性、隐性、等位基因遗传模式下 rs10981985位点单核苷酸多态性与皮质性 ARC患病风险相关性,结果显示在≥65岁组人群中rs10981985位点单核苷酸多态性与皮质性ARC患病风险显著相关。其中rs10981985A等位基因在≥65岁组人群中显著减低皮质性ARC患病风险(pc=0.004,OR:0.307,95%CI:0.140-0.674),在≥65岁组人群中AA和GA基因型个体皮质性 ARC患病风险显著低于 GG基因型个体(pc=0.028,OR:0.320,95%CI:0.136-0.755)。<br>　　6.在人类晶状体上皮组织细胞浆以及晶状体纤维细胞内皮质层TDRD7广泛表达。荧光定量PCR结果显示在皮质性ARC患者晶状体上皮细胞TDRD7的mRNA表达与年龄呈显著线性负相关(r=-0.487,p=0.001),而将样本依据年龄划分为两组,≥65岁组的皮质性 ARC患者晶状体上皮细胞 TDRD7的 mRNA表达水平显著低于<65岁患者(p=0.019)。在显性、隐性、等位基因型遗传模式下分析rs10981985位点单核苷酸多态性是否影响皮质性 ARC患者晶状体上皮细胞 TDRD7的 mRNA表达,结果提示 AA和 GA基因型的皮质性 ARC患者晶状体上皮细胞 TDRD7基因 mRNA表达高于 GG基因型皮质性ARC患者(p=0.001)。<br>　　7.HSPB1在人类晶状体上皮细胞浆以及晶状体纤维细胞内皮质层广泛表达。在显性、隐性、等位基因型遗传模式下分析rs10981985位点单核苷酸多态性是否影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞HSPB1的mRNA及蛋白表达,结果显示AA基因型皮质性ARC患者晶状体上皮细胞HSPB1基因mRNA(p=0.006)及蛋白表达(p=0.045)低于携带GG和GA基因型皮质性ARC患者。<br>　　8.CRYBB3基因在皮质性ARC患者晶状体上皮细胞的mRNA表达与年龄呈线性负相关(r=-0.337,p=0.031)。而将样本依据年龄划分为两组,结果提示<65岁组的晶状体上皮细胞CRYBB3蛋白表达高于≥65岁组表达(p=0.001)。在显性、隐性、等位基因型遗传模式下分析rs10981985位点单核苷酸多态性是否影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞CRYBB3mRNA和蛋白表达,结果显示rs10981985位点未影响皮质性ARC患者晶状体上皮细胞CRYBB3基因mRNA(p>0.05)及蛋白表达(p>0.05)。<br>　　研究结论:<br>　　1. TDRD7基因的rs10981985位点单核苷酸多态性在中国重庆地区汉族人群尤其是在≥65岁人群与ARC尤其是皮质性ARC发生风险显著相关,且突变A等位基因为 ARC发病的保护因素,其机制可能为起保护效应 A等位基因通过维持较高的TDRD7mRNA表达水平从而降低ARC发生风险。<br>　　2.rs10981985单核苷酸多态性可能通过调节HSPB1表达影响皮质性ARC发病机制。<br>　　3. TDRD7基因以及其他与白内障发病机制相关的重要基因共同调控HSPB1的表达可能为ARC发生的重要机制之一。