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摘要众所周知,雄激素对脑的结构和功能有多方面重要的调节作用,但是具体机制尚不清楚。在人类,老化相关的雄激素水平下降与认知障碍有关且是老年痴呆的危险因子,流行病学研究表明老年群体中较低雄激素水平的人群其认知功能同样也较低且更容易发展为老年痴呆。来自动物的实验证据表明雄激素参与调节脑的结构与功能的性别差异,特别是情绪、认知、学习记忆以及生殖功能等。在脑内,雄激素发挥作用可以有两种方式,一是通过其受体的直接方式,另一种为通过芳香化酶(aromatase,AROM)催化将其转化为雌激素(通常称为local estrogen即内源性雌激素,主要是雌二醇estradiol, E2)的间接方式,根据芳香化酶假说该方式直接决定了脑发育的性别差异。在直接方式中,雄激素与相应的受体即雄激素受体(androgen receptor, AR)结合进而调节靶基因的转录。在间接方式中,经由AROM催化雄激素转化而来的E2可通过其核受体(estrogen receptorα和β, ERα和ERβ)结合发挥经典的基因型调节效应,即调节靶基因转录的方式;或通过其与G蛋白耦联的、位于细胞膜和/或细胞内膜性结构如线粒体的膜性受体(G-protein coupled membranous estrogen receptor, GPER)结合进而通过胞浆内的第二信使系统发挥“非经典的”、产生快速生理效应的非基因型效应。经典的类固醇激素受体包括AR、ERα和ERβ都位于细胞核内,属于核受体超家族成员,然而近年来的研究发现多种经典的核受体在某些情况下也可位于胞浆甚至细胞膜且能通过第二信使系统发挥快速的非基因型调节作用,因此无论是雄激素还是雌激素,其具体的作用机制都非常复杂。目前认为,类固醇激素通过核受体调节靶基因转录的方式是类固醇激素发挥作用的主要方式。在此过程中的基本调节模式是:激素与核受体结合,捕获辅助活化因子(coactivator)或辅助抑制因子(corepressor),再捕获其它的转录调节因子与RNA聚合酶等多种转录所需元件,导致转录开始。<br>　　已经发现了数十种辅助活化因子,它们分别在不同的组织、器官或细胞内发挥作用,目前对p160家族研究得最多最深入。该家族包括三个成员,即类固醇受体辅助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1, SRC-1)、SRC-2和SRC-3,其分子量均为160kDa。SRC-1主要见于脑内,SRC-2和 SRC-3主要见于外周组织,其中 SRC-1是发现最早、脑内分布最广的类固醇受体辅助活化因子,敲除该基因导致运动学习障碍和小脑浦肯野细胞发育延迟,下丘脑注射SRC-1反义寡核苷酸证明它参与了对生殖功能的调控,但是到目前为止它在脑内的功能总体来说还很不清楚。前人的研究报道了SRC-1蛋白高表达于海马神经元内,神经胶质细胞内的表达很少甚至不表达;我们前期工作报道了脑内SRC-1蛋白的表达具有明显的性别差异,在雄性小鼠的多数脑区其表达都显著高于雌性的对应脑区;我们还报道其表达随老化而降低,且主要见于与学习记忆、运动等有关的脑区如海马、黑质等。由于海马是与学习记忆、情绪和认知关系最密切的脑区,海马的突触可塑性是学习记忆的基础,前人和我们的前期工作都显示海马内有高水平的 SRC-1蛋白表达,推测它可能参与了性激素对海马功能特别是突触可塑性的调节,为此我们采用性腺切除实验初步探讨了性激素对海马SRC-1表达的影响,意外地观察到卵巢切除仅短时影响海马SRC-1的表达,而睾丸切除后海马SRC-1的表达持续显著降低,强烈提示SRC-1可能主要参与了睾丸雄激素而不是卵巢雌激素对海马结构与功能的调节,然而SRC-1是否或如何介导雄激素对海马结构与功能的调节尚未见任何文献报道。<br>　　有鉴于此,本课题研究采用免疫组织化学、Western blot、透射电镜、Morris水迷宫、RNA干扰、免疫共沉淀等技术方法,首先检测了睾丸切除或芳香化酶抑制剂处理后全脑内各脑区SRC-1的表达变化,为进一步研究SRC-1可能参与了雄激素或内源性雌激素的哪些功能提供线索;然后采用睾丸切除(Orchiectomy, ORX)和/或芳香化酶抑制剂来曲唑(Letrozole, LET)处理观察海马SRC-1表达与突触可塑性及学习记忆改变之间的相关性;接下来进一步通过RNA干扰实验抑制海马SRC-1表达后检测了小鼠学习记忆和海马突触可塑性的变化;最后用小鼠海马神经元细胞株的体外实验证实了SRC-1对突触蛋白的抑制并对其可能机制进行了初步研究,主要结果如下:<br>　　1.SRC-1免疫阳性产物在成年雄性小鼠大脑的端脑、间脑、脑干和小脑等脑区广泛表达,主要定位于细胞核。ORX处理1个月后梨状皮质、嗅结节、海马、下丘脑背外侧核、腹外侧核及黑质等部位SRC-1蛋白的表达水平显著下降; LET处理1个月后隔内侧核、海马、背内侧核、腹内侧核、弓状核、上丘、中脑导水管周围灰质以及上橄榄旁核等核团内SRC-1蛋白表达水平显著下降。<br>　　2.ORX和LET处理1个月后海马SRC-1及突触可塑性相关蛋白谷氨酸受体GluR1、突触后密度蛋白-95(PSD-95)、树突棘素(Spinophilin)的表达较对照组显著降低,且变化模式高度相关;LET处理对SRC-1和突触蛋白的抑制较ORX处理更显著。透射电镜结果显示ORX和LET均能调节海马CA1区的突触密度与突触形态,但是LET较ORX的作用更强;而Morris水迷宫测试中,LET能够显著增加雄性小鼠的潜伏期,同时降低在目标象限的停留时间,而ORX对学习记忆行为无影响。<br>　　3.ORX后再给予LET的联合处理与单独应用LET的效果一致,并未引起海马突触蛋白表达、突触密度的进一步降低以及更严重的学习记忆障碍。<br>　　4.立体定位注射SRC-1 shRNA慢病毒可显著抑制海马SRC-1表达,并显著下调突触蛋白GluR1、PSD-95、spinophilin以及ERα、ERβ、AR的表达;海马CA1区棘突触密度及突触后致密物的厚度显著降低; Morris水迷宫实验表明小鼠有显著的空间学习记忆能力下降。<br>　　5.小鼠海马神经元细胞株mHippoE-14可表达神经元的各种标记物、多种突触蛋白以及核受体和SRC-1。体外培养的mHippoE-14细胞用SRC-1 shRNA抑制SRC-1表达后同样可下调 GluR1、PSD-95、Spinophilin等突触蛋白表达以及磷酸化 CREB的水平;免疫共沉淀结果显示SRC-1与磷酸化CREB存在直接的相互结合关系,且SRC-1表达受到抑制后其与磷酸化CREB相互结合的作用力显著降低。<br>　　主要结论:<br>　　1.ORX和LET均可显著降低多个脑区内SRC-1的表达,表明SRC-1可介导睾丸雄激素和内源性雌激素对脑的结构和功能多方面的调节。在与学习记忆、运动、神经内分泌、生殖和神经信息整合有关的脑区如基底前脑、海马、下丘脑、中脑,两种处理导致SRC-1的降低都很明显,强烈提示SRC-1介导了雄激素对这些核团的直接或间接效应。<br>　　2.ORX或LET对海马的SRC-1表达和突触可塑性均有一定的调节作用,以LET的效应更明显;行为学测试显示仅LET可导致学习记忆行为的改变,表明内源性雌激素比循环雄激素对海马SRC-1和学习记忆的影响更显著。<br>　　3.ORX+LET联合处理不能导致突触可塑性的进一步下降,可能是LET处理导致的内源性雌激素水平或 SRC-1表达的下降达到了某种“阈值”、因而 ORX后给予LET处理并未能进一步引起突触蛋白表达、突触密度的降低以及学习记忆行为的变化,同样表明内源性雌激素对调节海马SRC-1的表达、突触可塑性和学习记忆能力的重要性。<br>　　4.在体应用SRC-1 shRNA慢病毒抑制海马神经元SRC-1表达后突触可塑性的显著下降和学习记忆能力的下降。离体实验进一步证实了抑制神经元SRC-1表达可导致突触蛋白表达的显著下降以及磷酸化 CREB水平的下降。免疫共沉淀实验结果提示SRC-1和磷酸化 CREB能相互作用且受到 SRC-1表达水平的调节,提示 SRC-1能捕获磷酸化CREB进而调节突触蛋白基因的转录,最终对学习记忆行为产生深刻影响。<br>　　本课题通过一系列实验研究证实SRC-1介导了雄激素对海马的突触可塑性以及学习记忆行为的调节作用,并初步探讨可能的调节机制,同时我们还注意到内源性雌激素在调控海马突触可塑性与学习记忆方面可能具有较雄激素更重要的作用。本课题的研究为进一步深入阐明SRC-1在脑内的表达与功能提供了新的实验证据,为开发预防和治疗学习记忆与认知障碍的药物提供了新的靶点。由于老化相关的雄激素水平下降与认知障碍有关且是老年痴呆的危险因子,激素替代治疗包括雄激素替代和雌激素替代已经开始临床实验,用于预防或改善老化相关的神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)以及帕金森病(Parkinson disease, PD),因此本课题的研究也可为研发预防或治疗神经退行性疾病的新策略提供新的思路和新的希望。