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摘要目的：构建带有大鼠血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1-HO-1和化学合成HO-1-siRNA，分别以pcDNA3.1-HO-1和HO-1-siRNA体外转染培养的大鼠腹膜间皮细胞（rat peritoneal mesothelial cells,RPMCs），检测HO-1高表达和低表达对高糖作用下RPMCs过氧化损伤及TGF-β1、FN和Smads表达的影响，研究HO-1在腹膜透析所致腹膜纤维化中的作用及其机制。<br>　　方法：从SD大鼠脾脏中提取总RNA，经逆转录反应获取cDNA，以cDNA为模板，PCR法扩增大鼠HO-1基因的CDS区全长片段，PCR产物加“A”尾后连接至pMD-18T克隆载体，KpnⅠ和Bam HI内切酶双酶切pMD-18T-HO-1后获取HO-1片段，T4DNA连接酶将HO-1片段与KpnⅠ和Bam HI双酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(-)相连接，构建重组表达载体pcDNA3.1-HO-1。重组载体pcDNA3.1-HO-1经脂质体lipofectamine2000介导转染体外培养RPMCs，RPMCs分为正常对照组、2.5％高糖组、2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1转染组、pcDNA3.1空载体转染组，孵育6h后更换新的培养液，继续培养48h后，收集培养液上清,比色法检测上清MDA、GSH、SOD水平，ELISA检测TGF-β、FN含量，提取细胞总RNA及总蛋白，RT-PCR检测RPMCs中大鼠HO-1mRNA表达，Western blot检测RPMCs中大鼠HO-1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白的表达。设计3对针对大鼠HO-1基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA），化学合成HO-1-siRNAs和阴性对照siRNA，以脂质体lipofectamine2000将上述siRNA转染RPMCs，RT-PCR检测HO-1mRNA表达，筛选出干扰效率最高的1对HO-1-siRNA进行后续实验。RPMCs分为正常对照组、2.5%高糖组、2.5%高糖+HO-1-siRNA转染组、阴性对照siRNA转染组，转染后孵育6h，更换新的培养液继续培养48h，收集培养液上清及提取细胞总RNA和总蛋白，分别检测上清中MDA、GSH、SOD、TGF-β、FN的含量和细胞中HO-1 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白的表达。<br>　　结果：成功克隆了SD大鼠HO-1基因，构建的pcDNA3.1-HO-1载体经PCR扩增、KpnⅠ和Bam HI双酶切鉴定及测序验证，重组表达载体包含大鼠HO-1基因，且碱基序列与GeneBank中收录的大鼠HO-1序列一致。分离培养原代RPMCs，免疫组化鉴定结果可见，抗波形蛋白免疫组化染色阳性，而抗Ⅷ因子相关抗原及抗白细胞CD45抗体染色阴性，证实分离培养的是RPMCs。pcDNA3.1-HO-1转染RPMCs后检测发现，与正常对照组相比，2.5%高糖组RPMCs培养上清液中MDA含量明显升高（P<0.05），而SOD和GSH水平明显降低（P<0.05）。2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1转染组MDA含量较高糖组明显降低（P<0.05），而SOD和GSH水平则有明显升高（P<0.05）。空载体对照组与正常对照组相比，MDA、SOD和GSH水平均无明显差异（P>0.05）。ELISA检测结果表明，与正常对照组相比，2.5%高糖组RPMCs培养上清液中TGF-β1、FN水平明显升高（P<0.05），2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1转染组TGF-β1、FN水平较高糖组明显降低（P<0.05）。空载体对照组与正常对照组相比，TGF-β1、FN水平均无明显差异（P>0.05）。RT-PCR和Western blot检测结果表明，与正常对照组相比，2.5%高糖组RPMCs中HO-1mRNA和蛋白表达量明显升高（P<0.05），2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1转染组HO-1mRNA和蛋白表达量较2.5%高糖组有进一步升高（P<0.05）。空载体对照组与正常对照组相比HO-1mRNA和蛋白表达量无明显差异（P>0.05）。与正常对照组相比，2.5%高糖组RPMCs中p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白表达量均明显升高（P<0.05），2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1转染组p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量较2.5%高糖组明显降低（P<0.05），而Smad7蛋白表达量降低不明显（P>0.05），空载体对照组与正常对照组相比p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白表达量无明显差异（P>0.05）。siRNA干扰效率检测发现，与正常对照组相比，合成的3对HO-1-siRNA均能可不同程度地抑制RPMCs中HO-1mRNA的表达（P<0.05），其中HO-1-siRNA2干扰效率最高，而阴性对照siRNA对HO-1mRNA的表达无明显影响（P>0.05）。以HO-1-siRNA2转染RPMCs后检测发现，与2.5%高糖组相比，2.5%高糖＋HO-1-siRNA转染组HO-1mRNA及蛋白表达均明显下降（P<0.05），同时培养液上清中MDA、TGF-β1、FN含量均明显升高（P<0.05），而SOD和GSH水平则明显下降（P<0.05），伴有p-Smad2、p-Smad3蛋白表达升高和Smad7蛋白表达降低（P<0.05）。阴性对照siRNA转染组与正常对照组相比以上各项指标均无明显差异（P>0.05）。<br>　　结论：成功克隆了大鼠HO-1基因并构建了其真核表达载体pcDNA3.1-HO-1。HO-1基因转染可明显提高RPMCs中HO-1 mRNA及蛋白表达，而HO-1-siRNA干扰可明显降低RPMCs中HO-1 mRNA及蛋白表达。RPMCs中HO-1高表达可减轻高糖引起的过氧化损伤及致纤维化因子的产生，同时抑制p-Smad2、p-Smad3激活而提高Smad7功能。HO-1低表达则可加重高糖引起的过氧化损伤及致纤维化因子的产生，并增加p-Smad2、p-Smad3激活而降低Smad7功能。因此，HO-1可通过抗氧化损伤作用起到抑制腹膜纤维化的作用，HO-1的这一功能可能是通过调控Smads通路实现的。