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摘要目的：<br>　　在本室已构建Ad.RGD空载体和Ad.RGD-ING4重组腺病毒的基础上，再构建Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53单双基因重组腺病毒，研究其对人肺腺癌细胞(A549)的体内外抑制效应及潜在分子机制。<br>　　方法：<br>　　PCR克隆获得P53目的基因，在本室已成功构建pAdTrack-CMV-PolyA-promoter、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter转移质粒的基础上，在多克隆酶切位点NotⅠ和XhoⅠ之间插入P53目的片段，构建pAdTrack-CMV-PolyA-promoter-P53和pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter-P53重组转移质粒，再与RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAdeasy-1.RGD同源重组，经QBI-293A细胞包装、扩增和效价检测后获得高滴度重组腺病毒Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53。本项研究共分5组：PBS组、Ad.RGD空载对照组、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53单基因组、Ad.RGD-ING4-P53双基因组。将上述各组重组腺病毒分别感染A549肺癌细胞后，荧光显微镜及流式细胞仪(FCM)检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的感染效率。各组重组腺病毒感染A549肺癌细胞后，RT-PCR和Western blot法检测目的基因ING4或/和P53基因在QBI-293A细胞和A549肺癌细胞中的表达，采用MTT法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞增殖的影响，AnexinV-PE/7-AAD双染后，FCM检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的诱导凋亡效应，PI单染，FCM检测各组A549肺癌细胞的周期变化，细胞划痕实验和Transwell法检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。Real time-PCR检测A549肺癌细胞内凋亡、周期及迁移和侵袭相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、P21、Cyclin E、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平，Western blot法检测A549肺癌细胞内凋亡相关基因Bax、Bad和Bcl-xl的蛋白表达水平。用A549细胞建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型，通过观察并测量瘤体体积、重量研究ING4或/和P53基因表达对裸鼠人肺腺癌移植瘤的生长抑制作用，免疫组化检测瘤体细胞的凋亡和周期相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、P21及血管形成相关因子VEGF的蛋白表达水平。<br>　　结果：<br>　　PCR和酶切鉴定表明成功构建了pAd.RGD-P53和pAd.RGD-ING4-P53同源重组腺病毒质粒，包装扩增后各组重组腺病毒经效价检测可达109-1010 pfu/mL，各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的感染效率可达90-95％。RT-PCR和Western blot法证实了腺病毒介导的ING4或/和P53基因能够在QBI-293A细胞和A549肺癌细胞中成功表达。体外实验结果表明腺病毒介导的ING4或/和P53基因表达均能抑制A549肺癌细胞的生长，诱导细胞凋亡，阻滞细胞G1期进程，抑制细胞迁移和侵袭，且Ad.RGD-ING4-P53双基因组较Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53单基因组效果更优。体内实验结果表明ING4或/和P53单双基因重组腺病毒均能抑制A549裸鼠人肺腺癌移植瘤的生长，且双基因组较单基因组呈明显的抑瘤增效效果。分子机制检测表明ING4或/和P53基因表达能够上调细胞内凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bad，下调Bcl-2和Bcl-xl的表达，上调周期相关基因P21，下调Cyclin E的表达，下调肿瘤迁移和侵袭相关基因MMP-2和MMP-9的表达，下调肿瘤血管形成相关因子VEGF的表达，且双基因组优于单基因组。<br>　　结论：<br>　　1、成功构建RGD-4C修饰的单双基因重组腺病毒Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53。<br>　　2、RGD修饰的ING4或/和P53重组腺病毒均能显著抑制A549肺癌细胞的生长，诱导细胞凋亡，阻滞细胞G1期进程，并抑制细胞迁移和侵袭，且<br>　　Ad.RGD-ING4-P53双基因共表达组较Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53单基因组效果更为明显。<br>　　3、Ad.RGD-ING4-P53双基因共表达较Ad.RGD-ING4或Ad.RGD-P53单基因表达在体内对A549人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长产生更加显著的抑瘤效应。<br>　　4、腺病毒介导的ING4或/和P53基因表达能通过上调细胞内周期相关基因P21和下调Cyclin E的表达阻滞细胞G1期进程，上调凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bad和下调Bcl-2、Bcl-xl的表达诱导细胞凋亡，下调肿瘤迁移和侵袭相关基因MMP-2，MMP-9的表达抑制细胞的迁移和侵袭，下调裸鼠移植瘤内肿瘤血管形成因子VEGF的表达抑制肿瘤新血管的生成，且Ad.RGD-ING4-P53双基因共表达较Ad.RGD-ING4或Ad.RGD-P53单基因表达对上述因子的调控作用更为明显，这可能是双基因共表达发挥抑瘤增效作用的重要机制之一。