检索历史 清除

摘要目的：本研究通过构建人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）皮层蛋白pUL76的保守N端和非保守C端的真核表达载体，转染至真核细胞，确定pUL76引起染色体损伤的决定序列。<br>　　方法：通过PCR方法获取HCMV AD169株UL76基因的全长，保守N端和非保守的C端的编码序列并在扩增产物的两端分别加上BamHI和HindⅢ限制性酶切位点，然后构建至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1。构建的重组质粒分别命名为pEGFP-UL76，pEGFP-UL76N,pEGFP-UL76C。将构建的质粒通过双酶切和测序验证后分别转染HEK293细胞和HF细胞，IFA检测不同转染组染色体损伤信号γ-H2AX与绿色荧光蛋白的共定位情况，WB检测不同转染组染色体损伤信号γ-H2AX的相对表达量。彗星实验检测不同转染组细胞染色体损伤状况。<br>　　结果：<br>　　1.双酶切和测序结果显示pUL76全长、保守N端和非保守的C端编码序列均正确克隆至真核表达载体pEGFP-N1，用EGFP抗体做WB显示各片段均正确表达。<br>　　2.单独转染pUL76全长或非保守C端，IFA结果显示γ-H2AX与 EGFP融合蛋白共定位，且 WB结果显示γ-H2AX相对表达量较转染空载体（pEGFP-N1）对照组上升差异有显著性。单独转染pUL76保守 N端，γ-H2AX与EGFP融合蛋白不出现共定位现象，WB结果显示γ-H2AX相对表达量较转染空载体（pEGFP-N1）对照组上升差异没有显著性。<br>　　3.单独转染pUL76全长或非保守C端，彗星实验显示出现染色体损伤的细胞比例明显上升，而单独转染pUL76保守 N端，出现染色体损伤的细胞比例变化较对照组无明显差异。<br>　　4.单独转染pUL76全长或非保守C端细胞内荧光信号主要集中在核内，且绿色荧光信号聚集成斑块样；而单独转染空载体或pUL76保守N端细胞内荧光信号均匀分布整个细胞，不出现聚集现象。<br>　　结论：UL76非保守C端是引起染色体损伤的决定区域。