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摘要【背景与目的】<br>　　肝细胞癌（hepatocellsular carcinoma，HCC))是一种恶性程度高、预后差的常见肿瘤。治疗早期肝癌最为有效的方式是手术切除，但药物的化疗仍是中晚期肝癌患者重要的辅助治疗手段。黑色素瘤抗原(melanoma antigen gene，MAGE）在正常组织中仅表达于睾丸和胎盘中，而在各种肿瘤组织中高表达，与恶性肿瘤的侵袭、转移、复发、预后及耐药相关。化学合成MAGE-A3 siRNA小干扰片段，转染人肝癌细胞株HepG2及Huh-7，加入化疗药物处理，观察MAGE-A3沉默后对人肝癌细胞株 HepG2、Huh-7化疗药物敏感性的影响，并初步阐明相关的分子机制，探讨MAGE-A3基因在人肝细胞癌化疗药物治疗过程中所起的作用，为临床寻找提高肝癌化疗药物敏感性的方法奠定基础。<br>　　【方法】<br>　　1.培养表达MAGE-A3的人肝癌细胞株HepG2（P53野生型）和Huh-7（P53突变型），化疗药顺铂（Cisplatin,DDP）和阿霉素（Adriamycin,ADM）处理后，实验观察细胞生长情况，采用Q-PCR和Western Blot检测加药前后两种细胞中MAGE-A3 mRNA和MAGE-A3蛋白的表达情况。<br>　　2.针对MAGE-A3 mRNA体外化学合成siRNA，采用RNAi-Mate瞬时转染法转染HepG2，Huh-7细胞，实验分空转组（仅加转染试剂）、阴性对照组（加不相关小RNA）和MAGE-A3 siRNA干扰组（干扰组），倒置荧光显微镜观察转染效率，用Q-PCR和Western Blot检测转染后肝癌细胞MAGE-A3 mRNA和MAGE-A3蛋白的表达情况。<br>　　3.在MAGE-A3基因沉默的肝癌细胞中加入不同浓度的化疗药，MTT实验检测细胞生长抑制情况，计算半数抑制浓度(inhibitory concentration50，IC50)，比较MAGE-A3 siRNA转染前后肝癌细胞对化疗药物敏感性的变化，观察其变化是否通过MAGE-A3表达下调起作用。<br>　　4.流式细胞仪检测化疗药物作用前后肝癌细胞凋亡情况和细胞周期的改变，了解MAGE-A3基因沉默后肝癌细胞凋亡及细胞周期的变化。<br>　　5.MAGE-A3基因沉默前后，Q-PCR和Western Blot技术比较化疗药物处理的肝癌细胞中P53、Bcl-2、Bax、survivin、caspase3和caspase9基因的表达情况。<br>　　【结果】<br>　　1. HepG2、Huh-7细胞表达MAGE-A3，加入DDP和ADM处理后，HepG2、Huh-7细胞MAGE-A3的表达随着药物剂量的增加和作用时间的延长而增强。<br>　　2.MAGE-A3 siRNA664片段转染HepG2、Huh-7细胞24h、48h、72h，Q-PCR检测结果显示MAGE-A3基因的表达受到显著抑制，以转染后48h效果最佳，沉默效率达70％以上。Western Blot检测也证实该片段转染48h后两株细胞的MAGEA3蛋白表达水平显著下降。<br>　　3.MTT检测结果显示：DDP、ADM分别作用于HepG2、Huh-7细胞24h、48h、72h后，细胞的生长受到抑制，显示剂量依赖性和时间依赖性。转染MAGE-A3 siRNA后，HepG2细胞对DDP、ADM的敏感性分别提高1.57倍、2.15倍，差别有显著意义（P<0.05），而 Huh-7细胞对 DDP、ADM的敏感性分别提高1.22倍、1.21倍，统计学分析有差异（P<0.05）。<br>　　4.Annexin V检测HepG2、Huh-7细胞凋亡，结果显示：在不加化疗药物处理的情况下，HepG2细胞干扰组细胞凋亡率显著增加，差别有统计学意义（P<0.05），而 Huh-7细胞干扰组与对照组相比，统计学分析无明显差异(P>0.05)。加入DDP、ADM处理后，HepG2、 Huh-7细胞干扰组的细胞凋亡率均明显高于对照组，差别有统计学意义（P<0.05），提示沉默MAGE-A3能够增强DDP、ADM对HepG2、Huh-7细胞的细胞毒性作用，以HepG2细胞为显著。<br>　　5.碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)检测HepG2、Huh-7细胞周期，结果显示：MAGE--A3沉默后，两株细胞易阻滞于G2期；加入DDP处理，干扰组与对照组比较，HepG2、Huh-7细胞易阻滞于S期，加入ADM处理，干扰组与对照组比较，HepG2、Huh-7细胞易阻滞于G2期。<br>　　6.Q-PCR和Western Blot技术检测凋亡相关因子，结果显示：下调 MAGE-A3后，加入DDP、ADM处理，HepG2细胞中P53、Bax、caspase3、caspase9表达增加，而Bcl-2、survivin表达下降，提示MAGE-A3沉默增强HepG2细胞化疗药物细胞毒作用的可能机制是诱导 P53依赖的细胞凋亡通路；而 Huh-7细胞中突变型P53表达下降同时伴有Bax表达增加及survivin表达下降，但与Bcl-2、caspase3、caspase9的变化无相关性。提示MAGE-A3沉默影响Huh-7细胞化疗药物细胞毒作用可能涉及非P53依赖的细胞信号转导通路。<br>　　【结论】<br>　　1.化疗药DDP和ADM可诱导MAGE-A3的表达，沉默MAGE-A3能增强野生型P53和突变型P53肝癌细胞对化疗药物的敏感性。<br>　　2.凋亡涉及MAGE-A3 siRNA促进化疗药杀伤肝癌细胞的过程，可能与P53依赖的细胞凋亡通路关系更为密切。