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摘要小鼠Dlk1-Dio3印记区域位于12号染色体末端（12qF1），包含三个父本表达的蛋白编码基因和多个母本表达的长非编码RNA基因，以及大量的miRNAs和核仁内小RNA（snoRNAs）。已知这一印记区域内有三个父本甲基化的差异甲基化区（IG-DMR、Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）。miR-341和miR-1188是两个前体序列相距226 bp的miRNA，位于这一印记区域内Meg8的第二内含子中。已有研究表明，腺相关病毒载体在miR-341附近区域的定点整合会导致上、下游的长非编码RNA基因的表达水平显著上调，诱导肝癌的发生；而Sleeping Beauty转座子也会特异地插入到miR-341的上下游区域并引起突变，使附近基因的表达上调，促进肝癌的发生。这说明miR-341附近的插入突变会导致上下游基因的表达失调，暗示着miR-341的附近可能存在重要的DNA调控序列。CpG岛的预测表明miR-341和miR-1188的附近存在两个CpG岛（命名为CGI-1和CGI-2），其中CGI-1覆盖了miR-341的前体序列，CGI-2位于miR-1188下游约800 bp处。本文以小鼠Dlk1-Dio3区域内的miR-341/miR-1188和CGI-1/CGI-2为研究对象，分析了DNA甲基化在发育过程中的动态变化、组蛋白修饰的分布以及锌指蛋白CTCF在这一区域的结合情况，并构建载体分析了新的差异甲基化区CGI-2的绝缘子活性。<br>　　首先，本研究分析了miR-341和miR-1188的表达谱和印记状况。原位杂交的结果显示它们的初级转录本在E15.5天具有相似的表达模式，主要表达于脑、舌、肺、肝、胸腺、椎体软骨等部位；定量PCR的结果表明miR-341和miR-1188的成熟体在舌和肝中有较高的表达，脑和肺次之，肾中的表达较低，与初级转录本的表达模式是一致的；印记分析表明miR-341和miR-1188是两个母本表达的miRNAs。<br>　　其次，本研究分析了CGI-1和CGI-2的DNA甲基化模式及其在小鼠胚胎发育过程中的动态变化。亚硫酸盐测序分析表明CGI-2在E15.5和E18.5天的各组织中是一个母本甲基化的差异甲基化区；CGI-2在精子和卵细胞中都发生了高甲基化，在着床前的胚胎发育过程中逐渐去甲基化；着床后CGI-2发生了差异性的重新甲基化，它的母本等位快速地重新甲基化并一直维持高甲基化状态，而其父本等位在部分地重新甲基化后再次发生去甲基化；CGI-2在E7.5天之前建立起差异甲基化模式。CGI-1虽然在囊胚中也发生了去甲基化，但在小鼠精子、卵细胞、桑葚胚和着床后的胚胎中父母本都发生了高甲基化，并不具有等位差异性。<br>　　再次，本研究分析了差异甲基化区CGI-2及其上下游区域的组蛋白修饰的分布和CTCF的结合情况。ChIP实验的结果表明，组蛋白修饰H3K9me3广泛存在于CGI-2及其上下游区域；在肝脏中组蛋白修饰 H3K4me3和H3K9me3同时存在于CGI-2，但在胎盘中 CGI-2上只存在H3K9me3，缺乏激活性的H3K4me3。生物信息学预测表明在CGI-2及其上下游区域共存在四个高度保守的CTCF结合位点，但ChIP的结果显示在小鼠肝脏和胎盘中CTCF实际上只结合于第三个位点，即只结合于差异甲基化区CGI-2。<br>　　最后，本研究构建了绝缘子分析用的系列载体，初步分析了CTCF结合的差异甲基化区CGI-2的功能。软琼脂集落形成实验的结果表明CGI-2具有绝缘子的活性，且其绝缘子活性是依赖于CTCF结合位点的。<br>　　综上所述，本研究发现CGI-2是小鼠Dlk1-Dio3区域内的第一个母本甲基化的差异甲基化区。CGI-2在着床前后的胚胎发育中经历了复杂的去甲基化和重新甲基化的动态变化过程，并在E7.5天之前建立起差异甲基化模式。组蛋白H3K4me3和H3K9me3在肝脏中同时存在于CGI-2。CGI-2结合CTCF并具有依赖于CTCF结合位点的绝缘子活性。这些结果对于进一步研究小鼠Dlk1-Dio3区域内的印记调控机制具有重要的意义。