检索历史 清除

摘要目的：自噬和凋亡是决定细胞命运的重要因素，参与各种疾病的病理和生理过程。尽管随着研究的不断深入对自噬与凋亡的调控机制已经取得了重要进展，但关于沙眼衣原体引起的自噬和凋亡的具体调控机制尚未清楚。本研究试图探讨沙眼衣原体质粒蛋白 pORF5对 HeLa细胞自噬和凋亡的影响，为进一步阐明沙眼衣原体的致病机制提供实验依据。<br>　　方法：将pDSRed C1/pORF5重组菌接种在LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养12～16h，挑取单个菌落，转种于LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养4h；按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书提取pDSRed C1/pORF5重组质粒；用含NheI、EcoRI酶切位点的pORF5特异性引物扩增pORF5基因，再分别双酶切 PCR扩增产物和慢病毒表达载体 DCE（PCDH-CMV-MCS-EF1-COPGFP）；酶切产物纯化后进行连接，并转化感受态细胞 DH5α，然后进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定；高纯度无内毒素抽提慢病毒表达重组质粒后，与辅助质粒共转染293T细胞，转染后8h更换培养基，继续培养48h，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，上清浓缩后得到高滴度的慢病毒颗粒，采用倍比稀释法检测病毒滴度；慢病毒感染HeLa细胞，荧光显微镜下观察感染情况；流式分选获得稳定转染细胞株 DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa；间接免疫荧光方法和Western blot方法鉴定稳定转染细胞株中pORF5的表达；血清饥饿处理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa细胞24h，qRT-PCR、Western blot和间接免疫荧光检测LC3（microtubule-associated protein1 light chain3）、Becin1的表达水平；TNF-α处理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率；DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均用血清饥饿和3-MA分别处理，RT-PCR检测细胞Bax和Caspase-3的表达情况。<br>　　结果:<br>　　1、成功建立DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa稳转细胞株，经过流式分选稳转株纯度达95％以上。<br>　　2、间接免疫荧光结果显示，饥饿处理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均出现LC3红色荧光斑点，定量后分别为（34.0±2.6个/细胞）和（97.6±12.1个/细胞），且DCE-pORF5-HeLa较DCE-HeLa点状荧光斑点明显增多（P<0.05）。<br>　　3、血清饥饿处理的DCE-HeLa细胞中LC3-II/LC3I比率和Beclin1蛋白表达水平比未处理组分别增加了56.0%（P<0.01）和57.8%（P<0.01）；血清饥饿组处理的DCE-pORF5-HeLa中LC3-II/LC3I比率和Beclin1的蛋白表达水平比未处理组分别增加了87.2%（P<0.01）和76.6%（P<0.01）；饥饿处理的DCE-pORF5-HeLa中LC3-II/LC3I比率和Beclin1的表达水平比同处理的DCE-HeLa分别升高了53.3%（P<0.01）和28.7%（P<0.05）。<br>　　4、饥饿处理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的mRNA表达水平较同处理的DCE-HeLa分别降低47.6%和25.7%（P<0.05），3-MA处理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的表达mRNA水平较同处理的DCE-HeLa分别低73.0%和43.6%（P<0.05）。<br>　　5、未处理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa细胞的凋亡率均低于5%，而TNF-α处理后6h后，DCE-pORF5-HeLa的凋亡率达为（44.4±6.0）%，对照组DCE-HeLa细胞凋亡率为（62.9±0.8）%，DCE-pORF5-HeLa凋亡率比DCE-HeLa细胞降低了29.4%（P<0.05）。<br>　　结论：1、pORF5质粒蛋白可诱导HeLa细胞自噬。<br>　　2、pORF5质粒蛋白可抑制HeLa细胞凋亡，机制与其诱导的自噬有关。