检索历史 清除

摘要目的：心源性猝死（Sudden Cardiac Death，SCD）绝大部分是由恶性心律失常所诱发的，但由于其恶性心律失常发病的机制仍不是非常清楚，临床上暂时无有效的预防和治疗SCD的方法。大量研究证实，hERG钾通道离子电流在动作电位的3期复极化中起着重要的作用，且已证实LQT2的发生是由hERG基因通道功能的改变引起的。在我国，以II型LQT2致命性心律失常多见。已有研究证实，microRNAs（miRNAs）参与了hERG途径的功能调节。本研究组前期已通过双荧光素酶报告基因法、实时定量 PCR、Western Blotting、激光共聚焦筛选出 miR-103a-1与 hERG基因具有相关性。本实验旨在在电生理水平进一步验证 miR-103a-1与 hERG的相关性，探讨 miR-103a-1作为新的工具来评估LQTS发生机制的可行性，并为研发新的高特异性抗心律失常药提供新思路。<br>　　方法：常规培养的人胚肾细胞（HEK293T）是进行膜片钳实验理想的细胞系。瞬时转染hERG后进再一步转染cel-miR-67、miR-103a-1或miR-103a-1加AMO-103a-1。pRK5-GFP用于监测转染效率。cel-miR-67作为随机阴性对照。应用全细胞膜片钳技术检测miR-103a-1对hERG蛋白通道的Ikr电生理特性的影响，HEK293T细胞收获在24小时（仅hERG质粒），48小时（hERG后再转染miR-103a-1或cel-miR-67）或72小时（hERG的质粒随后的miR-103a-1和AMO-103a-1）转染后相对应。<br>　　结果：1. miR-103a-1对hERG通道Ikr电流幅度的影响：<br>　　miR-103a-1干扰 hERG前后Ikr激活电流幅度分别为660.67±159.55 pA和253.72±47.35 pA，干扰后比干扰前显著降低了61.60％（n=6，p<0.05）；尾电流的电流幅度分别为981.28±5.94 pA和376.23±2.84 pA，干扰后比干扰前降低了61.66%（n=6，p<0.05）。而阴性对照cel-miR-67未能影响Ikr激活电流（干扰前：660.67±159.55pA，干扰后：691.30±143.57 pA，4.6%，n=6，P>0.05）和尾电流（cel-miR-67干扰前：981.28±5.94pA，干扰后：985.79±3.96 pA，0.45%，n=6，P>0.05）的幅度。正如预期的，AMO-103a-1可以沉默 miR-103a-1的影响。共转染 miR-103a-1和AMO-103a-1的细胞激活电流幅度从253.72±47.35 pA(n=6)（仅转染hERG和miR-103a-1）恢复到595.75±99.08 pA(n=6)(p<0.05),同样尾电流的幅度也从376.23±2.84 pA恢复到984.58±6.49 pA(n=6)(p<0.05)。与仅转染 hERG的细胞相比，共转染 miR-103a-1和AMO-103a-1显示出在激活电流（595.75±99.08 pA vs660.67±159.55 pA，p>0.05）和尾电流（984.58±6.49 pA vs981.28±5.94 pA，p>0.05)方面仅有微小的差异。<br>　　2.miR-103a-1对hERG通道Ikr电流的特性的影响。<br>　　（1）miR-103a-1干扰hERG钾通道前后Ikr电流的斜率因子从9.99±0.34 mV减少为6.88±0.44 mV（n=6，P<0.05），而半激活最大电压分别为-8.66±0.38 mV和-25.31±0.52 mV（n=6，p<0.05）。与野生型hERG通道相比，miR-103a-1干扰hERG后使得通道明显向复极化方向偏移，斜率变小。有趣的是，cel-miR-67干扰 hERG前后V1/2分别为-8.66±0.38 mV和-20.07±3.30 mV（n=6，p<0.05），而斜率因子K没有变化（9.99±0.34 mV VS9.49±0.27mV，n=6，p>0.05）。转染miR-103a-1加AMO-103a-1干扰hERG前后V1/2分别为-8.66±0.38 mV和-18.64±0.45 mV(n=6，p<0.05)，K分别为9.99±0.34 mV和8.29±0.39 mV（n=6，p>0.05）。转染 miR-103a-1加 AMO-103a-1与只转染 miR-103a-1干扰hERG前后V1/2和K没有统计学差异（p>0.05）。<br>　　（2）稳态失活电流中，miR-103a-1干扰hERG前后V1/2和K没有明显变化（干扰前V1/2=-39.07±3.13 mV，K=14.96±2.88 mV；干扰后V1/2=-46.88±4.35mV，K=11.30±3.90 mV；n=6，p>0.05）。同样cel-miR-67干扰hERG前后V1/2和K也没有统计学差异。转染miR-103a-1加上AMO-103a-1干扰hERG前后V1/2和K同样也没有明显变化。转染miR-103a-1加AMO-103a-1与只转染miR-103a-1干扰hERG前后V1/2和K没有统计学差异。<br>　　（3）miR-103a-1干扰 hERG后Ikr电流的失活速度更快（n=6，P>0.05），另外，AMO-103a-1几乎消除了miR-103a-1的影响，而阴性对照cel-miR-67没有影响hERG通道蛋白的失活时间常数。<br>　　（4）miR-103a-1或cel-miR-67干扰hERG前后Ikr电流失活后恢复时间常数没有差异（n=6，P>0.05），并且对 IKr去失活恢复时间常数的快、慢成分也无显著性差异（n=6，P>0.05）。<br>　　结论：我们的研究结果表明hERG基因是miR-103a-1的靶基因。AMO-103a-1可以沉默miR-103a-1的影响。我们的研究结果为更好的了解hERG蛋白通道的作用机制提供了新的见解，并为进一步基因治疗LQTS打下了基础。然而，这些结果需要在动物模型中、临床前研究和临床研究中一步验证。