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三株太湖溶藻细菌及其溶藻活性物质的研究

摘要中国第二大淡水湖——太湖,是一个典型的浅层淡水湖泊,同时也是沿岸三千万居民生活用水、工业用水、农业用水的主要来源。从上世纪80年代开始,由于农业集约化和工业污染,太湖水质不断下降,目前处于严重富营养化状态。近20年来太湖爆发了严重的蓝藻水华,铜绿微囊藻和聚球藻是太湖蓝藻水华中主要藻类。目前,多采用物理、化学和生物等方法用来控制蓝藻水华,但物理方法耗费较大,化学方法易造成二次污染,生物方法因其专一、高效和环境友好受到越来越多的关注。研究显示溶藻细菌能够导致蓝藻水华的消退,因此溶藻细菌具有控制蓝藻水华的巨大潜力。<br>  本研究首先从太湖蓝藻水华中筛选和鉴定溶藻细菌。2010年10月在太湖梅梁湾采集水样,筛选到7株具有溶藻效果的溶藻细菌。根据16S rRNA基因测序结果,7株溶藻细菌分别为黄杆菌Lzh-1、希瓦氏菌Lzh-2、鞘氨醇杆菌Lzh-3、芽孢杆菌Lzh-4、芽孢杆菌Lzh-5、黄杆菌Lzh-6和嗜麦寡养食单胞菌Lzh-7。在7株溶藻细菌中,希瓦氏菌Lzh-2、鞘氨醇杆菌Lzh-3和芽孢杆菌Lzh-5具有较强的溶藻能力,用于下一步研究。<br>  测定了三株溶藻细菌希瓦氏菌Lzh-2、鞘氨醇杆菌Lzh-3和芽孢杆菌Lzh-5的溶藻效率、溶藻范围和溶藻模式。三株溶藻细菌Lzh-2、Lzh-3和Lzh-5对铜绿微囊藻9110的溶藻效率分别为92.3±6.8%、92.8±7.5%和91.2±6.3%(6天);希瓦氏菌Lzh-2对聚球藻BN60的溶藻效率为84.9±3.9(6天),而鞘氨醇杆菌Lzh-3和芽孢杆菌Lzh-5对聚球藻 BN60无溶藻效果。三株溶藻细菌对其它蓝藻如颤藻BN35、绿色微囊藻FACHB-979和铜绿微囊藻PCC7806等同样也具有很好的溶藻效果,说明这三株溶藻细菌也具有较好的溶藻广谱性。同时三株溶藻细菌的溶藻模式均为通过分泌溶藻活性物质来实现对蓝藻的溶藻。三株溶藻细菌均具有应用于控制太湖蓝藻水华的潜力。<br>  依次运用乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和高效液相色谱等技术手段从三株溶藻细菌的发酵液中分离纯化出了溶藻活性物质,然后通过液质联用、气质联用和核磁共振等技术手段综合确定了溶藻活性物质的化学结构。希瓦氏菌Lzh-2分泌溶藻活性物质S-2A(六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮,俗称环甘氨酸-脯氨酸)和S-2B(二氢吲哚-2,3-二酮,俗称靛红),鞘氨醇杆菌Lzh-3分泌溶藻活性物质S-3A(六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮,俗称环甘氨酸-脯氨酸)和S-3B(3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮,俗称环丙氨酸-亮氨酸),而芽孢杆菌Lzh-5则分泌两种溶藻活性物质S-5A(六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮,俗称环甘氨酸-脯氨酸)和S-5B(3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,俗称环脯氨酸-缬氨酸)。这四种溶藻活性物质(环甘氨酸-脯氨酸、靛红、环丙氨酸-亮氨酸和环脯氨酸-缬氨酸)都是可以生物降解的。为定量这些溶藻活性物质的溶藻能力,测定了溶藻活性物质对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的半致死量。环甘氨酸-脯氨酸、靛红、环丙氨酸-亮氨酸和环脯氨酸-缬氨酸对铜绿微囊藻9110的半致死量分别为5.7μg/mL、12.5μg/mL、8.2μg/mL和19.4μg/mL;靛红对聚球藻BN60的半致死量为34.2μg/mL,而其他三种溶藻活性物质对聚球藻 BN60无溶藻效果。这四种溶藻活性物质具有应用于太湖蓝藻水华控制的潜在价值。<br>  在铜绿微囊藻9110藻液中加入溶藻活性物质共培养24 hr后,藻细胞的形态发生明显的变化。靛红能够导致铜绿微囊藻藻细胞的细胞分裂异常。环甘氨酸-脯氨酸、环脯氨酸-缬氨酸和环丙氨酸-亮氨酸都能够使铜绿微囊藻藻细胞的细胞壁破裂和细胞裂解。聚球藻BN60藻液藻液中加入溶藻活性物质靛红共培养24 hr后,细胞形状从圆形变为不规则,而其他三种溶藻活性物质不会引起 BN60藻细胞形态的变化。<br>  监测了溶藻过程中溶藻细菌、溶藻活性物质和蓝藻的动力学变化,连续测定了菌藻混合液中溶藻细菌菌浓、溶藻活性物质浓度和蓝藻藻浓度。溶藻过程中,只有当溶藻细菌浓度达到一定阈值后,才开始分泌溶藻活性物质。溶藻活性物质浓度由溶藻细菌菌浓决定,而溶藻细菌的溶藻效率依赖于溶藻活性物质浓度。总体上讲在高于溶藻细菌密度阈值后,溶藻细菌菌浓、溶藻活性物质浓度和溶藻细菌溶藻效率具有正相关的关系。

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