LDOC1在人甲状腺乳头状癌中的表达及作用机制研究-论文-万方医学网

LDOC1在人甲状腺乳头状癌中的表达及作用机制研究

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摘要甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）是一种起源于甲状腺滤泡上皮细胞的分化型恶性肿瘤，是甲状腺癌最常见的病理类型。近年来甲状腺癌的发病率不断攀升，其中增长最快的主要是 PTC，且发病年龄趋向年轻化，女性多见，严重威胁着人类健康。PTC临床症状不典型，多表现为缓慢生长的甲状腺结节而不易被察觉，多于健康体检中被查出，有可能耽误了最佳的治疗时期。总体来说，PTC预后相对较好，但少部分PTC病人在极早期阶段就发生了甲状腺外侵犯，甚至淋巴结转移，此类病人的PTC除侵袭性强外，对治疗亦不敏感，多于术后反复出现转移和复发。因此，对PTC发生发展的相关分子靶点和分子机制进行探讨，探寻新的有效的PTC分子生物学诊断、治疗和预后监测标志物，是当前PTC临床治疗和基础研究中面临和亟待解决的严峻课题。 　　癌症亮氨酸拉链下调因子1（Leucinezipper down-regulatedin cancer1，LDOC1）是Nagasaki等于1999年运用差异显示技术（Differential Display）发现的在RNA水平差异表达的基因。LDOC1基因定位于Xq27，其编码蛋白具有亮氨酸拉链样结构域及SH3-binding模序，可通过其亮氨酸拉链样结构域与其它转录因子形成同二聚体或异二聚体调节基因转录，亦可通过SH3-binding结合信号通路蛋白参与细胞内信号转导。研究报道LDOC1在前列腺癌、肝细胞癌的组织标本中存在差异表达。另有研究显示 LDOC1在宫颈癌、卵巢癌因发生 DNA甲基化修饰而表达下降。据报道，LDOC1可使口腔黏膜细胞发生致瘤性转化。LDOC1在某些肿瘤及炎症性疾病中存在差异表达，并与肿瘤的形成、细胞凋亡等密切相关，这些结果在不同的细胞类型、不同的疾病状态并不完全一致。截止目前，LDOC1在PTC中的表达分布、临床价值还不明确，国内外缺乏LDOC1对PTC细胞生物学功能影响的研究。 　　核转录因子（Nuclear factor-κB,NF-κB）是涉及许多细胞因子表达的关键转录因子，在免疫反应、细胞增殖凋亡、侵袭迁移及新生血管形成等方面扮演重要角色，且多项研究证据表明NF-κB在包括PTC在内的多种肿瘤细胞中持续活化。目前已有关于 LDOC1对 NF-κB活性影响的报道，但这些结果并不一致。Nagasaki等的研究表明，在胰腺癌细胞系BxPC-3中，LDOC1以剂量依赖方式抑制TNFα和PMA刺激的NF-κB转录活性。Lee等通过NF-κB荧光素酶报告实验证实在OC3及TW2.6细胞系中，LDOC1以剂量依赖方式有效抑制TNFα刺激的NF-κB转录活性，immunoblotting进一步证实LDOC1以剂量依赖方式下调P65蛋白表达。而song等对胆道闭锁的研究中，LDOC1促使NF-κB活性增强，激活下游炎症因子，导致胆道上皮细胞炎症损伤。对于PTC，LDOC1是否影响NF-κB的活性目前仍未见报道。 　　TGF-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）在细胞的生长分化、组织修复及免疫功能等诸多方面发挥重要作用。TGF-β是一把双刃剑，具有促癌或抑癌的双向功能，取决于细胞类型、疾病状态及所处的微环境等。在甲状腺肿瘤中，TGF-β介导的生长抑制效应因 NF-κB激活而被剥夺，给予NF-κB抑制剂后，TGF-β恢复生长抑制及促凋亡效应。我们推测，若LDOC1影响PTC细胞NF-κB的活性，是否会恢复PTC细胞对TGF-β抑制信号的反应性。为此，本实验开展以下研究。 　　第一部分 LDOC1在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义 　　目的： 　　观察LDOC1在PTC癌组织、PTC细胞系及正常甲状腺组织中的表达情况，初步探讨LDOC1在PTC中的潜在临床价值。 　　方法： 　　1.收集126例PTC患者癌组织标本及对侧正常甲状腺组织47例，同时收集56例PTC癌组织及33例正常组织的存档蜡块。 　　2．釆用免疫组织化学（immunohistochemical，IHC）和qRT-PCR方法检测PTC癌组织和正常甲状腺组织中LDOC1蛋白和mRNA的表达情况，分析LDOC1的表达水平与PTC患者临床病理参数的关系。 　　3.检测PTC细胞中LDOC1的表达，为基因干预研究提供理论依据。 　　4.采用IHC对 PTC标本中 P65的表达进行检测，分析LDOC1与P65表达量的相关性。 　　结果： 　　1.PTC癌组织LDOC1 mRNA表达水平低于正常组织，差异具有统计学意义（P<0.01）。依据AJCC标准TNM分期中肿瘤的T状态，LDOC1 mRNA水平在T1，T2，T3期均下降，且T1>T2>T3，差异均有统计学意义（P<0.05）。 　　2. PTC中LDOC1阳性表达率低于正常甲状腺组织，差异具有统计学意义（P<0.01）。核P65在PTC癌组织的表达高于正常甲状腺组织，差异有统计学意义（P<0.01）。Spearman相关性分析显示，LDOC1和核P65在PTC组织中的表达呈负相关（χ2=7.458,P=0.006）。 　　3.与正常甲状腺组织相比，PTC细胞中LDOC1 mRNA及蛋白表达水平均下降，差异有统计学意义（P<0.05），其中TPC-1细胞下降更明显。 　　结论： 　　1. LDOC1在PTC组织低表达且与原发肿瘤的大小有关系，提示其可能参与了PTC发生发展的过程。 　　2. PTC组织中LDOC1与核P65表达量负相关。 　　第二部分 LDOC1对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1生物学行为的影响 　　目的： 　　通过体内和体外实验研究LDOC1对PTC细胞TPC-1生物学行为的影响，为进一步探讨其参与PTC发病的分子机制提供理论依据。 　　方法 　　1.借助重组慢病毒载体技术将外源hLDOC1 cDNA感染TPC-1细胞。荧光显微镜下观察感染效果，流式细胞术检测感染效率。qRT-PCR及Western blot检测Lv-LDOC1、Lv-NC及UNT组LDOC1表达水平。 　　2. Lv-LDOC1、Lv-NC及UNT三组细胞以300个/孔的细胞量接种于6孔板，持续培养2周后观察克隆形成能力。 　　3.采用TUNEL检测上调LDOC1表达后，UNT、Lv-NC及Lv-LDOC1三组细胞凋亡率变化。 　　4.通过观察单层细胞的人为划痕癒合速度来间接评估细胞迁移能力。 　　5.利用铺Matrige胶的Transwell小室实验，观察过表达LDOC1对TPC-1细胞的侵袭能力影响。 　　6.釆用皮下注射稳定感染LDOC1 cDNA的TPC-1细胞构建裸鼠荷瘤模型，在体内进一步观察LDOC1对甲状腺乳头状癌生长和增殖等的影响。 　　结果： 　　1.借助重组慢病毒载体成功将外源hLDOC1 cDNA感染TPC-1细胞。荧光显微镜下观察，绿色荧光见于视野中90％以上的细胞；流式细胞仪测定的感染效率均在95%以上；qRT-PCR及Western blot结果示LDOC1在Lv-LDOC1组表达量高于UNT及Lv-NC组，差异有统计学意义（P<0.05），UNT与Lv-NC两组比较无差别（P>0.05）。 　　2.LDOC1抑制TPC-1细胞的平板克隆形成能力。与UNT及Lv-NC组比较，Lv-LDOC1组克隆集落形成率最低，差异有统计学意义（P<0.01），UNT与Lv-NC两组比较无差别（P>0.05）。 　　3.TUNEL法检测的UNT、Lv-NC及Lv-LDOC1三组细胞的凋亡率分别为（9.07±1.45）%、（10.33±0.91）%和（16.80±2.46）%。与其他组相比，Lv-LDOC1组细胞凋亡率最高（F=17.29，P<0.01），UNT及LV-NC组凋亡率无区别（P>0.05）。 　　4.Lv-LDOC1组细胞的迁移能力显著降低。单层细胞划痕实验表明，无血清培养48 h后，UNT、Lv-NC组的划痕距离明显缩小，划痕将近愈合，而Lv-LDOC1组细胞的划痕距离虽有减少，但明显宽于UNT及Lv-NC组（均P<0.01）。 　　5.LDOC1对TPC-1细胞侵袭转移能力无明显影响。Transwell小室的侵袭实验结果表明，UNT、Lv-NC及Lv-LDOC1组细胞在transwell小室中培养24 h及48 h后，与UNT及Lv-NC组相比，Lv-LDOC1组聚碳酸酯膜下室面的细胞数无明显减少（P>0.05）。 　　6.Lv-LDOC1组肿瘤终重量和终体积均小于UNT及Lv-NC组，差异具有显著性（F=7.538，P<0.05/F=59.830，P<0.001），UNT组与Lv-NC组无明显差异（P>0.05）；肿瘤组织HE染色示：UNT及Lv-NC组有大量核大深染的肿瘤细胞，核染色质明显，核仁清晰可见，大量肿瘤细胞周围有少许纤维组织包绕，而Lv-LDOC1组肿瘤细胞少，见较多的纤维组织；TUNEL染色发现，Lv-LDOC1组肿瘤细胞凋亡明显多于UNT及Lv-NC组（P<0.05）。 　　结论： 　　1.LDOC1基因可抑制甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖和迁移能力，促进凋亡，对细胞侵袭能力无明显影响。 　　2. LDOC1基因可在体内抑制TPC-1细胞裸鼠移植瘤的生长。 　　第三部分 LDOC1通过调控NF-κB活性促进甲状腺乳头状癌细胞凋亡 　　目的： 　　探讨LDOC1促进TPC-1细胞凋亡的可能机制，为LDOC1可能作为临床治疗靶点提供实验基础和理论依据。 　　方法： 　　1.相同数量的UNT、Lv-NC及Lv-LDOC1细胞（1000个/孔）接种于96孔板，每天同一时间点采用CCK-8法检测三组细胞数量的变化，观察一周。 　　2.对Lv-NC及Lv-LDOC1细胞同步化处理后，利用流式细胞术分析细胞周期变化。 　　3.对Lv-NC及Lv-LDOC1细胞进行APC-Annexin V and7-AAD双染后，利用流式细胞术检测凋亡率；分析UNT、Lv-NC及Lv-LDOC1三组细胞凋亡相关基因表达水平：qRT-PCR测定Bax、c-Myc、Bcl-xl mRNA水平，Western blot检测Bax、cl-PARP、cl-Caspase3、c-Myc、Bcl-xl蛋白水平。 　　4. Lv-NC及Lv-LDOC1细胞给予TNFα10 ng/mL刺激30 min，采用western blot及免疫荧光检测NF-κB p65蛋白胞质及胞核分布情况；TNFα10 ng/mL刺激Lv-NC及Lv-LDOC1组细胞24 h，pNF-κB-Luc双荧光素酶报告基因实验进一步验证NF-κB的反式激活能力。 　　5. Lv-NC及Lv-LDOC1细胞给予不同剂量的TNFα（0~20 ng/mL）持续刺激5天后，CCK-8测定细胞活力；TNFα10ng/mL刺激Lv-NC及Lv-LDOC1细胞30min或24h（IκBα），Western blot测定Bcl-xl、Bax、c-Myc、IκBα蛋白水平。 　　6. rTGF-β15 ng/mL作用于Lv-NC及Lv-LDOC1细胞24 h及48 h，Western blot测定核P65及总IκBα蛋白水平；流式细胞术测定rTGF-β15 ng/mL作用48 h时，细胞周期变化；rTGF-β15 ng/mL作用于Lv-NC及Lv-LDOC1细胞12 h,24 h,48 h时，CCK-8测定细胞活力。 　　结果： 　　1. LDOC1可抑制TPC-1细胞生长。Lv-LDOC1组细胞数自第3天起即明显低于UNT及Lv-NC组，差异有统计学意义（P<0.05），UNT与Lv-NC组细胞数自始至终无明显区别。 　　2. Lv-LDOC1组SubG1期细胞所占比例高于Lv-NC组，两组比较P<0.01，LDOC1可能通过促进TPC-1细胞向SubG1期转换从而抑制了细胞增殖。 　　3. LDOC1促进TPC-1细胞发生凋亡。Lv-LDOC1组细胞的凋亡率（17.1%）低于Lv-NC组（11.8%），差异有统计学意义（P<0.05）；与UNT及Lv-NC组相比，qRT-PCR示Lv-LDOC1组促凋亡基因Bax mRNA表达上调，凋亡抑制基因c-Myc mRNA及Bcl-xl mRNA水平下降；Western blot示LDOC1基因转染组Bax、cl-PARP、cl-Caspase3蛋白水平升高，c-Myc及 Bcl-xl蛋白水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。 　　4.LDOC1抑制了基础的及TNFα刺激的NF-κB活性。Western blot示TNFα刺激能活化NF-κB，促进p65入核增多，过表达LDOC1能减少基础的及TNFα刺激的p65入核，差异有统计学意义（P<0.05）。LDOC1虽可使总p65表达量下降，但均未达到统计学标准（P>0.05）；免疫荧光实验也表明LDOC1下调了基础的及TNFα刺激下的核内p65的量；最后pNF-κB-Luc荧光素酶报告基因实验进一步验证基础的及TNFα刺激所引起的NF-κB转录活性均可被LDOC1显著抑制（P<0.05）。 　　5. LDOC1增强了TNFα引发的细胞凋亡效应。CCK-8实验结果表明，TNFα任一剂量下持续作用5天，Lv-LDOC1组细胞活力均低于Lv-NC组，LDOC1可降低TPC-1细胞活力；Western blot结果示，LDOC1可使IκBα量升高，上调促凋亡蛋白Bax表达，同时下调抗凋亡蛋白c-Myc水平，均P<0.05。 　　6.过表达LDOC1促进TPC-1细胞对TGF-β1抑制信号的反应性。Western blot结果示，在rTGF-β15ng/mL作用下，Lv-LDOC1组在0h，24h，48h核内P65量均低于 Lv-NC组，差异有统计学意义（P<0.05）；细胞周期分析表明LDOC1促进细胞向SubG1期转换，P<0.01；CCK-8结果表明，在rTGF-β15 ng/mL作用12h,24h,48h，LDOC1均使TPC-1细胞活力下降，均P<0.05。 　　结论： 　　1. LDOC1抑制TPC-1细胞增殖，促进凋亡及凋亡相关蛋白表达，其机制可能是通过抑制基础的及TNFα刺激的NF-κB活性来实现。 　　2. LDOC1通过抑制NF-κB活性，改善了TPC-1细胞对TGF-β1抑制信号的反应性。