Galectin-1在肝癌中表达的临床意义及其调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的研究-论文-万方医学网

Galectin-1在肝癌中表达的临床意义及其调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的研究

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摘要研究背景： 　　肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)作为现在全球发病率以及死亡率极其高的肝脏恶性肿瘤之一，它的发病率在全球恶性肿瘤中排第五位，因为它非常高的转移率和复发率，致使肝癌病人的总体预后非常不乐观。现在我国有近1亿慢性乙肝病毒携带者，而HBV慢性持续感染是引发HCC的独立危险因素，因此，存在着一个庞大的HCC高危人群，继而导致我们国家的肝癌的病死率居高不下，位于恶性肿瘤排名的第二位。由于HCC起病隐匿、转移早，多半患者在临床确诊时已经错过最佳的切除治疗机会，同时肝癌对化疗和放疗方案的不敏感，加之化放疗治疗方案副作用较大。虽然目前部分肝癌病人能够进行实施根治性切除手术治疗，但是70％左右的肝癌切除术后患者会在5年内发生复发，导致针对原发性肝癌的治疗上来说人们依然需要面对更加庞大的挑战，因此，更精准的对肝癌病人的预后进行预测，采取措施防止肝癌病人肝内及肝外转移的出现、能够在分子水平提前对肝癌患者的转印进行诊断、同时挑选新型的、有效的、副作用小的治疗方法对肝癌病人干预并使病人得到及时准确的治疗对临床和人类来说有不可小觑的意义，寻找新型的且有用的肝癌的辅助治疗手段对提高肝癌的总体生存率显得尤为重要。 　　人类对分子生物学以及遗传学的技术认识逐渐地进步，使得我们对恶性肿瘤发生机制的研究也逐渐地深入。研究提示肿瘤细胞周围的免疫微环境，与肿瘤的进展和预后密切相关，癌症细胞就像一粒种子，如果离开合适的土壤就不能发芽，所以肿瘤的发生和发展不仅仅取决于肿瘤细胞本身的一些特性，同时也受肿瘤细胞适合生长发育的土壤的影响，也便是现在人们研究比较多的肿瘤微环境(Tumor microenvironment)。 　　半乳糖凝集素(galectin)（β-半乳糖苷结合蛋白）是动物凝集素的一种，它分布在多种哺乳动物体内的多种器官组织中，实验表明，它与非常多的生理过程相关，譬如，细胞的粘附、增殖、分化、凋亡及炎症，另有肌肉分化、神经干细胞的成长及造血谱系等；近年来的研究证实 galectin的表达与肿瘤的增殖、转移、浸润和复发关系密切，由此，galectin蛋白很有可能成为癌症治疗领域的新治疗靶点。Galectin-1是在哺乳动物发现的第1个半乳糖凝集素，Galectin-1约14 kD（1 D=1 u），位于染色体22 q12上，由LSGALS1基因编码。 　　研究发现，galectin-1与T淋巴细胞关系密切。免疫组织包括中枢的和外周的，而在这些组织的细胞中发现galectin-1的广泛存在，galectin-1能够通过诱导中枢免疫组织胸腺和外周免疫组织中的T细胞的凋亡增加，继而发挥稳定T淋巴细胞微环境的作用和功能。研究报道，galectin-1不仅在癌症的转化和逃避免疫反应等生物学行为中起作用，而且在肿瘤生殖周期、凋亡、细胞迁移和转移等肿瘤生物学行为中发挥重要作用。另外，实验表明，galectin-1在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌和非小细胞肺癌等相当多的恶性肿瘤组织中高表达，并且和肿瘤的增殖和侵袭表型能力相关。 　　现有研究表明galectin-1参与肿瘤的疾病进展主要从以下几个方面进行： 　　(1)galectin-1能促进恶性肿瘤细胞的生长。在多种癌症体内模型中，包括卵巢癌、宫颈癌、肺癌、头颈部肿瘤等，采取相应方法，比如，galectin-1的特异性抗体、稳定转染或瞬时转染等，使galectin-1的表达下调后，发现肿瘤增殖能力下降。 　　(2)在胶质母细胞瘤细胞的体外实验中，研究者发现galectin-1能够增强胶质母细胞瘤细胞的侵袭和迁移能力；进一步的机制研究正事galectin-1蛋白能够调控趋化蛋白的合成及分泌从而加强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。 　　(3)galectin-1蛋白能够依靠加速血管内皮细胞的活化及增殖或强化促血管生成路径增进肿瘤血管生成。galectin-1能够通过与VEGF彼此作用同时联合NRP1继而增强血管内皮细胞的增殖及迁移能力。同时galectin-1能够减弱肿瘤微环境中的氧化应激反应对肿瘤细胞的损伤作用，发挥保护血管内皮细胞的作用。 　　(4)galectin-1与肿瘤的免疫逃逸。侵袭性高的肿瘤细胞高表达galectin-1，同时侵袭性高的肿瘤发生部位免疫环境受抑制，提醒我们肿瘤细胞高表达的galectin-1是通过毁坏T细胞效应的目的来产生免疫抑制作用。这一机制已得到了大量的实验验证，譬如，封锁黑色素组织中galectin-1的生物活性后，发现肿瘤体积缩小，同时体内肿瘤特异性的T淋巴细胞反应被明显活化。综上所述，galectin-1蛋白能够在肿瘤的发生发展和转移复发的多个环节中发挥重要的调控作用，这也提醒我们将galectin-1蛋白作为恶性肿瘤早期诊断以及预后判断的重要标志的可能性，同时开辟为生物治疗的新靶点，假使通过此针对性治疗能阻断癌症的信号转导，继而抑制癌症的增殖、侵袭、转移及血管生成，或者能通过其改善肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，那将是癌症治疗的创新性的未来。所以，探索galectin-1对肿瘤发生发展的功能作用和机制具有重要的临床转化意义。而目前，关于galectin-1蛋白在肝细胞肝癌中功能和原理的实验研究报道较少。 　　1995年Wiley等［1］从人类心肌cDNA文库中克隆得到了TNF（tumor necrosis factor）超家族中的一员，TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）即Apo2L（apoptosis-2 ligand）。作为TNF超家族的一员，galectin-1有自己特殊的功能和作用，它能够对肿瘤细胞凋亡的具有选择性诱导，并且更重要的是这个过程中并不损害正常细胞，galectin-1蛋白这个特征使得其与其它T NF超家族成员TNF和FasL之高毒性有很大区别，另外，TRAIL这一特征使得其在肿瘤治疗领域有着重要的临床应用优势，近年来galectin-1蛋白也逐渐成了的肿瘤治疗领域关注的焦点及基础研究的热点。 　　正因为TRAIL表现出的选择性抗肿瘤优势，故临床研究中在TRAIL的基础上的各种类型和作用机制的抗肿瘤方案处于不断的探索阶段。大批临床试验证实：某些肿瘤细胞对TRAIL治疗表现出抵抗性的原因是由于TRAIL相关死亡受体的低表达或凋亡抑制蛋白的过高表达。I-Ⅱ期临床研究结果证实，如果可以在TRAIL治疗基础之上联合应用激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂可以很大程度上提高TRAIL耐药的肿瘤细胞对TRAIL的反应。此外由于可溶性TRAIL半衰期短，如果我们在临床上长期使用也会产生耐药问题，使得基于TRAIL的肿瘤靶向治疗在临床应用中很大程度上受限。 　　某些肿瘤细胞对TRAIL反应差，而部分研究表明，如果与某些药物配合应用能很好地提高TRAIL的抗肿瘤能力。同时，随着科技发展，尤其是分子成像技术，辟如生物发光成像技术的发展，使得从化学文库中筛选增强TRAIL凋亡诱导活性的分子从不可能变成可能。所有可以改变凋亡相关分子表达或活性情况的原因，均可以改变TRAIL诱导的凋亡，有关TRAIL的肿瘤治疗策略会通过人类对TRAIL和它关联的死亡受体的表达情况、TRAIL相关联的凋亡引导过程及此过程的调节的深入研究变得更加完善。TRAIL制剂有可能作为人类治疗肿瘤的选择之一。TRAIL的选择性引起癌细胞凋亡给人们治疗HCC的带来了新想法。TRAIL诱导的有针对性的细胞广泛凋亡为目前HCC的处理开辟了新方向。一些学者针对TRAILR的表达情况和TR AIL引起的凋亡情况在HCC中的体现进行了研究，竟然得到TRAILR1/R2/R4存在于6种HCC细胞株中，唯独TRAILR3单独存在于2种HCC细胞株中，并且多数HCC细胞株对单独的TR AIL存在抗性,同时联合使用化疗方案能够增强TRAIL的杀癌作用。 　　基于以上研究背景，本研究拟检测肝癌细胞和组织中galectin-1的表达程度，并探讨galectin-1表达程度和HCC病人临床特征及预后的关联，探索galectin-1基因成为HCC的分子诊断、预后判断指标可能性。同时研究了下调galectin-1对肝癌细胞生物学行为的影响，以及调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的影响，论证了galectin-1蛋白作为肝癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性，为进一步体内的实验研究和临床应用提供理论依据。 　　第一部分 Galectin-1在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达及其与患者临床预后的相关分析 　　目的： 　　研究galectin-1在肝癌组织中的表达及其和临床特征及预后的关系 　　方法： 　　1.利用TCGA公共数据库中的肝癌基因芯片数据分析galectin-1 mRNA在肝癌组织中和癌旁组织的表达强度。 　　2．选用免疫组织化学方法及肝癌组织芯片技术检测 galectin-1蛋白在肝癌组织中的表达程度。 　　3.从mRNA和蛋白水平综合分析galectin-1表达程度与病人临床特征及预后之间的关联。 　　结果： 　　1．galectin-1 mRNA和蛋白表达水平在肝癌中明显高于正常肝组织。 　　2．galectin-1蛋白在出现转移和复发的患者中呈高表达水平。 　　3．galectin-1的高表达提示肝癌患者更短的总生存期，提示galectin-1在肝癌发生生长过程中可能发挥重要作用。 　　第二部分体外galectin-1基因敲减后对肝癌细胞生物学的影响目的： 　　利用RNA干扰技术沉默galectin-1基因，研究其对肝癌细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭的生物学行为的影响。 　　方法： 　　1．将靶向galectin-1的siRNA转染至肝癌细胞系SK-HEP-1和HUH-7； 　　2．利用RT-PCR和Western blot技术检测galectin-1mRNA和蛋白表达水平变化； 　　3．MTT法检测体外沉默galectin-1基因后对肝癌细胞增殖能力的影响； 　　4．流式细胞仪技术检测体外siRNA沉默galectin-1基因后对肝癌细胞凋亡的影响； 　　5．Transwell法检测体外siRNA沉默galectin-1基因后对肝癌细胞侵袭能力的影响； 　　6．Wound healing法检测体外siRNA沉默galectin-1基因后下调对肝癌细胞迁移能力的影响； 　　7．克隆形成实验检测体外siRNA沉默galectin-1基因后对肝癌细胞成瘤能力的影响。 　　结果： 　　1．转染siRNA之后，galectin-1的mRNA和蛋白表达水平降低，敲减实验成功。 　　2．Galectin-1基因敲减后肝癌细胞系的增殖能力变化不明显，迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降。 　　3. Galectin-1基因敲减后肝癌细胞系的凋亡率明显升高。 　　第三部分 Galectin-1通过Bcl-2和survivin调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的研究 　　目的： 　　通过构建bcl-2和survivin的过表达质粒载体，研究galectin-1调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的初步机制。 　　方法： 　　1．构建过表达bcl-2和survivin的质粒并鉴定； 　　2．将过表达bcl-2和survivin的质粒转染至肝癌细胞系，用G418进行筛选后，鉴定bcl-2和survivin在肝癌细胞中的mRNA和蛋白表达水平； 　　3．下调galectin-1对TRAIL受体DR-4，DR-5的影响； 　　4．MTT法检测galectin-1基因下调后对TRAIL的敏感性； 　　5．流式细胞仪技术检测 galectin-1基因下调后，TRAIL治疗引起的细胞凋亡率； 　　6．流式细胞仪技术检测galectin-1基因下调及过表达bcl-2和survivin后对肝癌细胞的凋亡的影响。 　　结果： 　　1．经RT-PCR和Western-blot鉴定，过表达bcl-2和survivin的质粒构建成功； 　　2．下调galectin-1对TRAIL受体DR-4，DR-5未见明显影响； 　　3．过表达Bcl-2和survivin能够逆转下调galectin-1引起的细胞凋亡； 　　4．下调galectin-1能够影响肝癌细胞对TRAIL的敏感性； 　　5．galectin-1通过Bcl-2和Survivin调节肝癌细胞对TRAIL的敏感性。 　　全文结论： 　　1．galectin-1在肝癌中表达明显升高，并和患者转移、复发率等临床恶性表型密切相关，同时galectin-1低表达患者的生存时间明显高于galectin-1的高表达患者。 　　2．下调galectin-1后，肝癌细胞的增殖能力无明显改变，凋亡率明显升高，迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降。 　　3．下调galectin-1能够增加肝癌细胞对TRAIL的敏感性。 　　4．galectin-1通过调控Bcl-2和Survivin的表达继而调节肝癌细胞对TRAIL的敏感性。