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摘要免疫生物治疗是继手术、放疗与化疗外第四种抗肿瘤治疗的新方法，尤其在侵袭性和转移性肿瘤治疗方面更是显示出良好的应用前景。树突状细胞(Dendritic cells，DC)作为抗原特异性免疫应答的始动者，能高效摄取、加工、处理和提呈抗原。DC还可显著激活初始T细胞，在免疫应答的启动、调控方面发挥关键作用。成熟的DC高表达与抗原提呈相关的主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)Ⅰ类分子和MHCⅡ类分子，摄取肿瘤相关抗原提呈给T细胞，激活相应的CD4+T细胞和CD8+T细胞。成功刺激宿主体内的DC成熟并高效提呈肿瘤抗原具有重要研究意义。肿瘤抗原DC疫苗是一种非常有应用前景的抗肿瘤治疗方法，但由于DC的体外培养费用较高、技术操作复杂以及体内靶向DC的抗原疫苗容易降解且抗原性弱等原因，应用肿瘤抗原DC疫苗进行肿瘤免疫治疗受到一定限制。因此，探索如何提高肿瘤抗原DC疫苗体内的抗肿瘤生物活性尤为重要。本研究制备负载肿瘤抗原的甘露糖(Mannose，M)与CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)共修饰的脂质体(Liposome，Lipo)，并将其用于小鼠肿瘤模型的治疗。研究结果表明负载肿瘤抗原的甘露糖与CpG-ODN共修饰的脂质体可靶向DC并使其成熟，在小鼠肿瘤模型中能有效激活效应细胞，达到抗肿瘤免疫治疗的作用。本研究的内容与结果如下:<br>　　1.负载肝癌H22细胞裂解物的甘露糖与CpG-ODN共修饰脂质体(M/CpG-ODN-H22-Lipo)抗肝癌作用及机制研究。<br>　　背景:免疫治疗在提高肝癌患者治愈率、延长患者生存时间方面均取得了良好的效果。肿瘤抗原DC疫苗是免疫治疗的研究热点之一，探索提高肿瘤抗原DC疫苗在体内抗肿瘤生物活性的新方法具有重要研究意义。<br>　　目的:制备M/CpG-ODN-H22-Lipo并用于小鼠肝癌的免疫治疗，研究其抗肝癌作用机制。<br>　　方法:将软脂酸与甘露糖胺通过脱水缩合反应生成甘露糖脂(Mannoseglycolipids，mannoselipid)，进而与脂质体(Lipo)反应制备甘露糖修饰的脂质体(Mannose-conjugated Liposome，M-Lipo);采用Post-insertion方法将CpG-ODN连接至M-Lipo，得到M/CpG-ODN-Lipo，进一步包裹肝癌H22细胞裂解物得到纳米粒子M/CpG-ODN-H22-Lipo。利用傅里叶红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR)与X射线衍射(X-RayDiffraction，XRD)技术验证甘露糖脂是否制备成功;再利用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering Instrument，DLS)及透射电子显微镜(TransmissionElectron Microscope，TEM)对M/CpG-ODN-H22-Lipo的粒径大小、形貌以及表面电位进行表征分析。细胞吞噬实验验证M-Lipo对DC的靶向性。流式细胞术验证M/CpG-ODN-H22-Lipo的免疫刺激活性及其稳定性。建立BALB/c小鼠肝癌模型，通过皮下注射的方式用M/CpG-ODN-H22-Lipo对荷瘤小鼠进行治疗。活体成像技术研究纳米粒子在小鼠体内分布及代谢情况。流式细胞术检测小鼠体内骨髓前体抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell，MDSC)与调节性T细胞(T-regulatory Cell，Treg)的数量。酶联免疫斑点分析(Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT)检测肝癌小鼠脾脏中干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)阳性细胞的频率，酶联免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)检测肝癌小鼠血清中免疫球蛋白IgG水平，免疫组织化学法(lmmunological Histological Chemistry，IHC)检测肿瘤局部的血管密度、细胞核增殖及细胞凋亡情况。观察荷瘤小鼠生存时间与肿瘤生长情况，使用公式计算肿瘤体积。通过封闭荷瘤小鼠体内CD8+T细胞与自然杀伤细胞(Nature Killer Cell，NK)并观察小鼠生存时间以研究发挥抗肝癌作用的主要效应细胞。<br>　　结果:成功制备M/CpG-ODN-H22-Lipo，其粒径为130nm左右，呈球形，表面带负电荷，包封率为52.9％。该纳米粒子能有效靶向DC并使其成熟，在含50％血清的PBS中具有稳定的免疫刺激活性。M/CpG-ODN-H22-Lipo可有效抑制肝癌小鼠肿瘤生长并延长其生存时间，降低肿瘤局部与骨髓中MDSC以及脾脏中Treg的数量，提高脾脏中IFN-γ阳性细胞的频率，抑制肝癌小鼠体内肿瘤血管生成及肿瘤细胞增殖，并促进肿瘤细胞凋亡。进一步研究发现经M/CpG-ODN-H22-Lipo治疗后，肝癌小鼠血清IgG水平升高，CD8+T细胞与NK细胞是M/CpG-ODN-H22-Lipo在体内发挥抗肝癌作用的主要效应细胞。<br>　　结论:M/CpG-ODN-H22-Lipo能靶向DC并刺激其成熟，在小鼠肝癌模型中产生高效的抗肝癌免疫反应。<br>　　2.负载酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)肽的甘露糖与CpG-ODN共修饰脂质体(M/CpG-ODN-TRP2-Lipo)抗黑色素瘤作用及机制研究。<br>　　背景:黑色素瘤的恶性程度较高，容易发生转移。但其肿瘤抗原相对较为明确，对肿瘤抗原DC疫苗反应良好，有关黑色素瘤的肿瘤抗原DC疫苗试验在临床中占的比例较高。诱导肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)是肿瘤抗原DC疫苗用于免疫治疗的关键。<br>　　目的:制备M/CpG-ODN-TRP2-Lipo并用于小鼠黑色素瘤的免疫治疗，研究其抗黑色素瘤作用机制。<br>　　方法:参照第一部分的研究方法制备M/CpG-ODN-TRP2-Lipo，利用DLS及TEM对M/CpG-ODN-TRP2-Lipo的粒径大小、形貌与表面电位进行表征分析。建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型，通过皮下注射方式用M/CpG-ODN-TRP2-Lipo对荷瘤小鼠进行治疗。观察荷瘤小鼠生存时间与肿瘤生长情况，使用公式计算肿瘤体积。使用流式细胞术检测小鼠体内CD3+CD25+T细胞、MDSC和Treg的数量，四聚体染色检测体内TRP2肽特异性CD8+CTL的频率;ELISPOT检测脾脏IFN-γ阳性细胞的频率。IHC检测肿瘤局部的血管密度、细胞增殖以及细胞凋亡情况。原位四聚体染色(In Situ TetramerStaining，ISTS)检测肿瘤局部TRP2肽特异性CD8+CTL的频率。使用M/CpG-ODN-TRP2-Lipo治疗髓样分化主要反应基因88(MyeloidDifferentiation Primary Response Gene 88，MyD88)缺陷的C57BL/6小鼠并观察其生存时间以探讨M/CpG-ODN-TRP2-Lipo在体内的抗肿瘤机制。<br>　　结果:成功制备M/CpG-ODN-TRP2-Lipo，其粒径为100nm左右，呈球形，表面带负电荷，包封率为60.8％。该纳米粒子能有效抑制黑色素瘤小鼠的肿瘤生长并延长其生存时间。可降低黑色素瘤小鼠肿瘤局部、骨髓以及脾脏中MDSC的数量，降低脾脏中Treg的数量，升高IFN-γ阳性细胞以及TRP2肽特异性CD8+CTL的频率;有效抑制肿瘤组织血管生成、抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。ISTS法检测结果显示经M/CpG-ODN-TRP2-Lipo治疗后肿瘤局部有TRP2肽特异性CD8+CTL聚集。进一步研究表明M/CpG-ODN-TRP2-Lipo的抗黑色素瘤作用与MyD88信号转导通路相关。<br>　　结论:M/CpG-ODN-TRP2-Lipo在小鼠黑色素瘤模型中产生高效的抗黑色素瘤免疫反应。