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摘要阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease，AD)是一种进行性认知功能障碍的神经退行性疾病。AD的主要神经病理学特征是由胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)沉积形成的老年斑(Senileplaque,SP)和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillarytangle,NFT)组成。根据“AD的金属离子假说”，金属离子加剧了Aβ沉积和tau过度磷酸化。AD大脑中存在金属的稳态失衡(主要是铜和锌)，铜和锌在体内可与Aβ配位并调节Aβ聚集过程。锌离子可以参与Aβ的形成过程，与淀粉样前体蛋白(Amyloidprecursorprotein,APP)及其剪切酶相互作用，进而促进Aβ的产生，加剧AD的进程;铜离子与Aβ相连接聚集在细胞膜表面，产生有毒的过氧化氢和羟基自由基、破坏细胞完整性进而造成神经元损伤。目前，有效的特异性金属螯合剂被认为是AD的潜在治疗剂，其目的是通过调节金属离子的分布来减少金属诱导的Aβ聚集和神经毒性。<br>　　噬菌体展示技术可以直接将肽的表型与编码肽的DNA连接起来，通过反复的生物淘选，在不明确多肽与靶标如何相互作用的情况下，可以从庞大的随机文库筛选出针对特定靶标的功能性短肽。选自噬菌体展示文库的金属结合肽，可作为潜在的治疗AD的生物相容性金属离子螯合剂。多肽具有较低的免疫原性，由于其简单的结构而易于合成并可与其他药物偶联。本文基于噬菌体展示技术，筛选新型的Cu(Ⅱ)/Zn(Ⅱ)结合肽，并探索其在金属-Aβ介导的AD防治中的应用前景。<br>　　本研究首先通过噬菌体展示技术筛选Cu(Ⅱ)/Zn(Ⅱ)结合肽，利用噬菌体随机七肽库与固定化金属离子螯合树脂相互作用，经过多轮亲和筛选后分别获得对Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)亲和力最高的2个噬菌体单克隆。其中亲Cu(Ⅱ)噬菌体展示的序列为SAQIAPH,命名为PCu;亲Zn(Ⅱ)噬菌体展示的序列为HMQTNHH,命名为PZn。PCu和PZn分别对Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)表现出良好的结合能力，作为后续相关应用研究的候选肽。<br>　　为了使选自噬菌体随机展示肽库的金属结合肽能够在体内长时间发挥药效，更好的应用于体内外实验。本研究将锌离子结合肽(PZn)作为目标药物，构建了PEG化壳聚糖纳米粒载药系统(PEG/CS-PZnNPs)来提高PZn的稳定性和生物利用度。制备的PEG/CS-PZnNPs粒径在100nm左右，稳定性良好，利用红外光谱确定了其结构。体外释放结果显示PEG/CS-PZnNPs具有良好的缓释特性。MTT实验和激光共聚焦显微图像表明，PEG/CS-PZnNPs能够顺利进入细胞且对细胞几乎没有毒性，显示出良好的生物相容性。<br>　　以上述构建的PEG/CS-PZnNPs药物输送体系为基础，进一步探究了PEG/CS-PZnNPs治疗阿尔茨海默病的机制。首先，在体外考察PZn与Zn(Ⅱ)的特异性结合能力，ELISA结果显示，PZn对Zn(Ⅱ)结合能力明显高于其它金属离子。利用ThT荧光检测及透射电镜检测证实了PZn具有抑制Zn(Ⅱ)介导Aβ聚集的能力。AD体外模型N2a-sw细胞相关实验结果显示，PEG/CS-PZnNPs能够显著降低细胞内锌水平、抑制锌离子诱导Aβ的分泌、改善锌离子引起的氧化应激并提高细胞存活率。同时，以APP/PS1转基因小鼠为AD模型，鼻饲给予6月龄小鼠PEG/CS-PZnNPs3个月后，Morris水迷宫和筑巢实验结果显示，小鼠的学习记忆能力显著改善。并且Aβ免疫组化和刚果红染色实验结果显示，PEG/CS-PZnNPs治疗后，小鼠脑内的Aβ斑块显著减少。WesternBlot结果表明，PEG/CS-PZnNPs治疗后，APP/PS1小鼠脑内α-分泌酶(主要是ADAM10)及其产物sAPPα和γ-分泌酶的表达无明显变化，但β-分泌酶BACE1及其产物sAPPβ的表达显著降低;Akt和GSK3β磷酸化水平明显升高，β-catenin磷酸化水平无明显变化;此外，Bcl-2水平无明显变化，但Bax的表达显著降低并且Bcl-2/Bax的比值显著升高。以上结果表明，PEG/CS-PZnNPs可能通过抑制APP剪切的淀粉样途径来减少Aβ的产生及沉积;并通过调节Akt/GSK3β/β-catenin信号通路抑制细胞凋亡、促进细胞增殖。上述研究结果显示，我们构建的PEG/CS-PZnNPs有潜力应用于AD的治疗。<br>　　同时，我们将通过噬菌体展示技术筛选出的铜结合肽PCu直接作为治疗肽，对其抑制Cu(Ⅱ)介导的Aβ聚集及Aβ生成的相关机制进行了探索。ThT荧光检测结果表明PCu能够抑制Cu(Ⅱ)诱导的Aβ聚集并避免形成毒性更高的寡聚体。随后，同样采用N2a-sw细胞作为AD的体外模型。体外细胞毒性实验结合ICP-MS金属检测表明，PCu具有良好的生物相容性，并且能够通过结合过量的铜离子而降低其引起的细胞毒性，起到保护细胞的作用。此外PCu可以抑制Cu(Ⅱ)介导的氧化应激并抑制Cu(Ⅱ)诱导的Aβ分泌。WesternBlot结果显示，PCu通过抑制Cu(Ⅱ)介导的淀粉样途径的β-分泌酶BACE1的表达，减少其产物sAPPβ的表达进而抑制Aβ的产生。上述研究结果表明，PCu有潜力应用于阿尔茨海默病的预防或治疗。荧光标记后PCu(FITC-PCu)的活体分布结果显示，PCu在体内清除速度较快，可能难以在体内发挥持久的药效，导致此类多肽的体内相关研究受限。因此，对PCu及此类多肽生物利用度的优化策略有待于进一步研究。<br>　　综上所述，本研究基于噬菌体展示技术，将获得的铜/锌结合肽及其所负载的纳米粒应用于体内、外AD模型中。结果均显示，获得的金属结合肽具有良好的金属离子调节能力，以及对金属介导的Aβ聚集和相关神经毒性的抑制作用，在AD的预防或治疗方面具有潜在的应用价值。为开发用于AD治疗的具有靶向金属离子特性的螯合剂提供了新的研究思路和基础理论。