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摘要阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease,AD)是一种渐进性的认知功能下降和记忆力衰减为主要临床表现的神经退行性疾病。目前，AD的主要病理特征是由细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)沉积形成的淀粉样斑块(β-amyloidplaques，APs)和细胞内微管相关蛋白tau(Microtubuleassociatedproteintau,MAPT)过度磷酸化导致的神经原纤维缠结(Neurofibrillarytangles,NFTs)。由于自噬不足等原因，Aβ和过度磷酸化的tau蛋白往往引起继发性慢性炎症。并且大量研究表明Aβ和NFTs可以激活AD患者脑内小胶质细胞，分泌大量炎症因子和细胞毒素，从而加速AD病程。已有研究表明，由于自噬在AD发病早期的缺失加剧了AD的病理进程。<br>　　本研究以小鼠小胶质细胞BV2细胞和原代小胶质细胞为体外模型，通过给予Aβ寡聚体(Aβoligomers,Aβo)处理，结合基因沉默或基因过表达，探索视神经蛋白(Optineurin，OPTN)在AD发病过程中对神经炎症的调控作用。体内模型以C57BL/6和APP/PS1转基因小鼠为研究对象，通过腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)病毒注射过表达相关基因，结合形态学及分子生物学等实验手段，探讨OPTN在AD发病过程中对神经炎症的调控作用。<br>　　为探讨其内在机制，首先整合分析了基因表达数据库(Geneexpressionomnibus,GEO)中正常人和AD患者脑组织转录组数据，发现黑素瘤缺乏因子2(Absentinmelanoma2,AIM2)炎症小体相关基因均被上调。进一步通过qPCR和Westernblot技术，确证AIM2炎症小体相关基因在C57BL/6和APP/PS1转基因小鼠脑组织中的表达差异。结果表明AIM2、凋亡相关斑点样蛋白(ApoptosisassociatedspecklikeproteincontainingaCARD,ASC)、剪切后的caspase1及分泌在胞外的白介素(Interleukin,IL)-1β在APP/PS1转基因小鼠的大脑皮层和海马部位均明显升高，表明AIM2炎症小体在AD模型小鼠中被激活。在BV2和原代小胶质细胞中，Aβo处理同样可以激活AIM2炎症小体。为了进一步确证OPTN对AIM2的调控作用，在BV2细胞中沉默OPTN。发现在Aβo的刺激下，OPTN沉默组的AIM2炎症小体活性相对于对照组明显上调。反之在OPTN过表达组中发现，随着OPTN表达量的逐渐增加，明显抑制AIM2炎症小体的活性。这些结果表明OPTN抑制AIM2炎症小体介导的炎症反应。<br>　　基于上述研究，进一步对GEO数据库中正常人和AD患者脑组织转录组数据进行GSEA分析，发现Toll样受体(Tolllikereceptor，TLR)和受体互作丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Receptor-interactingserine/threonine-proteinkinase1，RIPK1)信号通路被明显激活。鉴于此，在APP/PS1转基因小鼠的皮层和海马中，同样发现RIPK1的表达在转录水平和蛋白水平均明显上调。为了进一步探究OPTN在调控RIPK1介导炎症反应中的重要作用，首先在BV2细胞中沉默OPTN，然后检测RIPK1信号通路活性。结果表明，OPTN敲低后，RIPK1的蛋白水平以及IκBα的磷酸化水平明显增加，导致NF-κB的入核，进而促进IL-1β的转录。双荧光素酶实验结果也表明，NF-κB的结合活性显著上调。通过ELISA实验，发现IL-1β的分泌也明显增加。反之在OPTN过表达的BV2细胞中，RIPK1蛋白水平及其所介导的信号通路明显受到抑制。但在OPTN沉默组或过表达组RIPK1的转录水平均没有显著差异。因此，OPTN可能通过自噬或泛素蛋白酶体途径调控RIPK1信号通路活性。为验证此假设，在OPTN过表达的BV2细胞中，分别用MG132和巴佛洛霉素A1(Bafilomycinal,BafiA1)处理，结合Westernblot检测，发现只有MG132能够抑制RIPK1的表达。为进一步验证上述结果，在过表达Flag-RIPK1的BV2细胞中沉默或过表达OPTN,结合Flag-RIPK1免疫沉淀，利用泛素化抗体检测RIPK1的泛素化水平。结果发现，OPTN的表达量与RIPK1的泛素化呈现正相关性。该结果进一步证实OPTN通过泛素蛋白酶体途径负调控RIPK1的蛋白丰度。<br>　　基于以上结果，OPTN与RIPK1很可能存在直接的蛋白互作。为此，首先通过计算生物学的方法，预测OPTN和RIPK1的蛋白结构以及各自的活性氨基酸位点。进一步使用Haddock软件进行分子对接，发现OPTN和RIPK1存在潜在互作可能。为进一步确证分子对接结果，在HEK293T细胞中过表达OPTN-GFP和RIPK1-mcherry,通过共聚焦显微镜观察发现二者存在共定位现象。免疫共沉淀的结果也发现OPTN和RIPK1存在互作。为了进一步确定OPTN和RIPK1互作的具体功能域，利用计算生物学发现OPTN的IKKγ/NEMO和(UbiquitinbindinginABINandNEMOdomain,UBAN)功能域分别与RIPK1的proteinkinase-likeprotein和Deathdomain(DD)结构域存在潜相互作用。为此，分别对OPTN和RIPK1的功能域进行截除，结合免疫共沉淀，发现OPTN的UBAN功能域和RIPK1的DD功能域存在明显互作。<br>　　为了探讨OPTN对AD炎症的缓解作用，在APP/PS1转基因小鼠中通过AAV病毒海马注射回补OPTN基因之后，通过Westernblot发现AIM2、ASC以及caspase1的蛋白丰度明显下调。此外，RIPK1信号通路活性也明显受到抑制。通过Westernblot和免疫组化，发现OPTN表达后GFAP的蛋白水平和星型胶质细胞的活性被明显抑制。这些结果都表明OPTN对脑内炎症发生的抑制作用。<br>　　综上，本研究揭示了在AD发病过程中自噬受体蛋白OPTN对炎症的抑制作用。采用生物信息学、分子生物学和形态学等实验手段，发现在APP/PS1转基因小鼠中OPTN的表达降低。由于OPTN的缺失诱发AIM2炎症小体激活。基于此发现，进一步阐明在AD模型鼠中由于OPTN缺失导致RIPK1介导的炎症反应，加重AD发病过程中的炎症病理。在回补OPTN的APP/PS1转基因小鼠脑内，炎症现象得到明显缓解。