检索历史 清除

摘要哺乳动物的精子发生是一个复杂的细胞分化过程，可分为有丝分裂期、减数分裂期和精子形成期三个阶段。精原细胞通过有丝分裂产生初级精母细胞。初级精母细胞通过第一次减数分裂产生两个次级精母细胞，次级精母细胞的间期很短，不发生DNA复制就进入第二次减数分裂，形成单倍体的圆形精子细胞。圆形精子细胞通过一系列复杂的形态变化，发育为具有头、颈、尾结构的精子。精子发生过程受许多特异分子及细胞间作用的严格调节，包括染色体结构的变化及一系列特定基因的程序性表达。这些内在基因水平的变化又受许多外部因素如激素、环境因素及旁分泌细胞因子的影响。对调节精子发生过程中一系列特殊现象的分子机制所知甚少，尤其缺乏对关键调节基因的认识。本研究试图筛选出在精子发生过程中起关键作用的基因或蛋白，并研究其功能，从而进一步认识精子发生的分子机理。论文主要包括以下主要内容。 一．小鼠精子发生相关新基因(SRG-L)的全长克隆。在前期研究小鼠不同阶段生精细胞基因表达谱的过程中，发现了一个在精子发生后期高表达的新基因。随后将该基因PCR产物纯化、克隆、测序，发现该片段与GenBank中大鼠及猴的一个睾丸基因eDNA片段有很高的同源性，但均未见其相关功能的报道。根据已知的大鼠及猴的同源基因cDNA序列设计数对引物，利用重叠RT-PCR分别扩增出长度约为448bp、1122 bp、280bp、523bp和561bp的5个片段，经序列测定后进行拼接，得到2584 bp的cDNA片段。然后利用5'和3'cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNAEnds，RACE)技术，获得该基因的5'及3'末端序列，由此完成了该基因全cDNA的测定，该基因为一新的小鼠基因，命名为SRG-L(spermatogenesis related gene expressedin the late stages of spermatogenic cells)，并在GenBank中注册(接受号为AY352586)二．SRG-L表达特征分析。RT-PCR和Northern Blotting分析表明：该基因在早期A型和B型精原细胞中不表达，从双线期初级精母细胞阶段开始表达并逐渐上调，在粗线期初级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中均检测到高水平的mRNA，但在成熟精子中消失，具有明显的阶段特异性表达特征，并且组织特异性表达分析显示该基因在睾丸组织中的呈高表达。Western Blotting和免疫组织化学染色分析进一步证实，SRG-L基因产物主要存在于双线期/粗线期精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中。因此初步判断这个基因在减数分裂早期被激活，转录在整个精子形成期维持较高水平的表达，有可能在精子发生后期起特殊作用，与减数分裂和精子变态成形相关。 三.SRG-L生物信息学分析。经GenBank/Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索，证明这SRG-L序列为一个新的小鼠基因，全长cDNA为2843bp，包括2625bp完整的开放阅读框架(open reading frame，ORF)，50bp-2674bp为编码区，编码产生874个氨基酸的蛋白，分子量为104KD。翻译起始密码ATG上游-3位是A，下游+4位是G，构成AGAATGG，属于典型的“Kozak”序列。3′UTR 2831nt处有poly(A)尾，其上游29nt有典型的加尾信号(AATAAA)，无典型的启动子序列，如CCAAT box或TATA box。同源分析显示小鼠SRG-L与GenBank中大鼠、猴、人和狗等的同源基因无论在核酸水平还是编码蛋白水平都具有较高的同源性，表明该基因在进化上的高度保守。经Genebank/Blast分析，SRG-L定位在小鼠第八号染色体短臂33.1位点，跨越基因组29Kb，由18个外显子和17个内含子组成，外显子和内含子之间符合标准的ag/gt法则。生物信息学分析显示在其N端184-270aa可能存在一跨膜区，预测该氨基酸序列为非分泌型蛋白，并且分别在Ser、Thr及Tyr存在多个潜在的磷酸化修饰位点和5个潜在的甲基化修饰位点。SRG-L不存在N端信号肽，线粒体定位序列，内质网膜滞留信号，RNA结合序列等。GenBank/NCBI Conserved Domain Search(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测SRG-L可能存在两个保守的结构域，分别是N端的(178-210aa)Transglutaminase/protease-like homologues domain和C端的(723-766aa)D-serine dehydratasedomain。结合SRG-L表达特征，推测该蛋白很可能在精子发生后期精子成熟过程中发挥特异作用，值得对其功能进行深入的研究。