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摘要大豆苷元为异黄酮类化合物，主要存在于豆科植物如大豆和葛根中。大豆苷元的药理作用丰富，除传统的对心脑血管系统作用外，还具有雌激素样作用、治疗骨质疏松作用、抗癌及对癌细胞的分化诱导作用等。本论文对大豆苷元在大鼠体内的药物动力学与代谢进行系统研究，为提高其口服生物利用度合成大豆苷元系列前体药物，阐明大豆苷元及其前体药物的吸收机制，并进行前体药物的药物动力学研究，以筛选具有良好生物膜亲和性和较高生物利用度的新前体药物。 一、大豆苷元在大鼠体内的药物动力学与代谢研究 以染料木素(genistein)为内标，建立测定生物样品中游离大豆苷元的液相色谱一串联质谱分析方法(LC／MS／MS)，并进行了完整的方法确证。大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸的浓度由酶水解后测得的大豆苷元总浓度减去未经水解测得的游离大豆苷元的浓度即得。通过对质谱条件、色谱条件、提取方法、水解条件以及内标的考察优化了分析方法。固定相为Diamonsil C<,18>柱(200×4.6 mm，I.D.,5μm)，以乙腈∶水∶甲酸(80∶20∶1，v／v／v)为流动相，流速为0.8 mL／min。采用大气压化学电离源(APCI源)以正离子方式检测，扫描方式为选择反应监测(SRM)。该法的线性范围为0.24-10000 ng／mL，定量下限0.24 ng／mL，日内和日间精密度(RSD)均小于11.6％，准确度(RE)在±3.7％范围内，大豆苷元和内标染料木素在大鼠血浆中的提取回收率分别为75.1％和64.2％。本文建立的方法在灵敏度、动态范围和测试速度等方面均优于文献方法。 采用建立的分析方法研究了大豆苷元及其主要代谢物大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸在大鼠体内的药物动力学、组织分布、代谢和排泄行为。大鼠灌胃给予20mg／kg大豆苷元溶液后，迅速吸收并代谢转化为大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸，大豆苷元和大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸的达峰时间分别为0.46和0.40 h，达峰浓度分别为601.1和3000 ng／mL。以游离大豆苷元计算绝对生物利用度为12.8％，以大豆苷元总量(大豆苷元和大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸)计算绝对生物利用度为47.0％，表明大豆苷元溶液在大鼠体内具有良好而快速的吸收，但由于存在很强的首过代谢导致原形药物的生物利用度较低。剂型因素对大豆苷元的药物动力学行为影响很大，大豆苷元溶液和混悬液在大鼠体内的药物动力学过程存在显著差异，以游离大豆苷元计算，混悬液给药的绝对生物利用度(12.8％)低于溶液给药(6.1％)。灌胃和静脉注射给予大豆苷元后，大豆苷元及大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸在大鼠体内迅速分布于各组织和脏器，血浆、消化道、肝、肾等组织中的浓 度较高。脑中亦可检测到药物，表明大豆苷元可以透过血脑屏障。大豆苷元在大鼠体内具有很强的肝肠循环。大豆苷元主要以原形药物和大豆苷元-7-O-葡萄糖苷酸的形式从胆汁中排泄。大豆苷元在大鼠体内主要发生葡萄糖苷酸结合代谢，并产生大豆苷元-葡萄糖苷酸-硫酸结合物及少量的单羟基化代谢物。 二、大豆苷元前体药物的化学合成及抗缺氧活性的初步筛选 为阻断大豆苷元的首过代谢以提高口服生物利用度，合成大豆苷元二甲醚、羟乙基醚和5个新的氨基甲酸酯类衍生物。体内代谢研究表明仅吗啉甲酸酯(DP-3)、二甲胺甲酸酯(DP-5)、乙基哌嗪甲酸酯(DP-6)和哌啶甲酸酯(DP-7)等4个化合物具有前体药物的性质。抗缺氧活性初步研究表明，二甲胺甲酸酯(DP-5)和哌啶甲酸酯(DP-7)的抗缺氧作用优于大豆苷元(P＜0.01)。 三、大豆苷元及其前体药物的吸收机制研究 正辛醇/水和脂质体/水系统中大豆苷元及其前体药物的lgD<,O/B>和lgD<,L/B>与Caco-2细胞模型所得的表观渗透系数P<,app>具有良好的相关性，而磷脂膜色谱中受试药物的lgk<,LAM>与Caco-2细胞模型所得的表观渗透系数P<,app>相关性较差，表明正辛醇/水与脂质体/水系统在评价大豆苷元及其前体药物的膜亲和性上与Caco-2细胞模型更为接近，可用于新药研发初期作为高通量筛选的有效工具。在磷脂膜色谱系统中评价参数受到药物结构、性质的影响较明显，但磷脂膜色谱方法简单，可重复性强，能对候选化合物提供一定的膜转运信息。 受试药物在Caco-2细胞的表观渗透系数(P<,app>)表明，除DP-6外，其它受试化合物均具有良好的细胞透过性，预测其在体内具有较好的吸收，属于吸收良好的药物类别。经结构修饰后，DP-5、DP-7、DP-3的细胞透过性均在一定程度上优于原药大豆苷元。大豆苷元及其前体药物在Caco-2细胞的转运均没有明显的方向性，被动扩散是其主要转运机制。 四、大豆苷元前体药物大鼠体内药物动力学研究 建立了同时测定生物样品中大豆苷元及其前体药物的液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)，并对分析方法进行了优化考察和方法确证。固定相为DiamonsilC<,18>柱(200×4.6mm/I.D.,5μm)，以乙腈：水：甲酸(80:20:0.5,v/v/v)为流动相，流速为0.85mL/min。采用大气压化学电离源(APCI源)以正离子方式检测，扫描方式为选择反应监测(SRM)。本论文建立的方法灵敏、准确，选择性强，大豆苷元及其前体药物的线性范围均为0.01-60.0μg/mL，定量下限0.01μg/mL， 日内和日间精密度(RSD)均小于14．8％，准确度(RE)在±13．9％范围内，大豆苷元及其前体药物在大鼠血浆中的提取回收率均高于63．7％，只需50uL血浆即可满足大豆苷元血药浓度的测定要求。 大鼠以50 mg／kg剂量灌胃给药大豆苷元前体药物后，除DP-5在2．10 h达到大豆苷元的峰浓度外，其它3个前体药物均在0．6 h左右达到大豆苷元的峰浓度。灌胃给药后大豆苷元的半衰期分别为1．32 h(DP-3)、3．54 h(DP-5)、3．31 h(DP-6)和19．8 h(DP-7)。将给药剂量按等摩尔折算为相当于大豆苷元的相同剂量(20 mg/Kg)，计算得到DP-3、DP-5、DP-6和DP-7等4个前体药物的AUC<,0-∞>值分别为1．51、14．5、1．33和9．84 ug·h／mL，相对于大豆苷元的生物利用度分别为44．7％、428．8％、39．3％和291．O％。等摩尔的四个大豆苷元前体药物在大鼠体内释放大豆苷元的量的顺序依次为DP-5>DP-7>DP-3>DP-6，与正辛醇／水、脂质体／水系统、磷脂膜色谱以及Caco-2的结果基本一致。DP-5相对于大豆苷元的生物利用度为428．8％，AUC<,O∞>值增加了三倍多，DP-7也增加了接近两倍，表明经过适当的结构修饰，DP-5和DP-7的药物动力学行为较大豆苷元有很大的改善，DP-5和DP-7是具有良好口服生物利用度的新的大豆苷元前体药物。 本论文通过大豆苷元在大鼠的体内过程研究，发现其溶液在体内具有良好的吸收，但口服生物利用度低，主要原因是强的首过代谢。为阻断首过代谢以提高口服生物利用度，依据前体药物理论，合成了大豆苷元前体药物。抗缺氧活性初步研究表明，二甲胺甲酰酯(DP-5)和哌啶甲酰酯(DP-7)的抗缺氧作用优于大豆苷元。Caco-2细胞实验表明大豆苷元及4种前体药物的吸收机制主要为被动扩散，正辛醇／水和脂质体／水系统可以作为适合的评价系统用于指导大豆苷元前体药物的设计与合成。以Caco-2细胞模型预测了4种前体药物的体内吸收情况，并对其在大鼠体内的药物动力学进行了研究，表明二甲胺甲酸酯(DP-5)和哌啶甲酸酯(DP-7)是具有良好口服生物利用度的新的大豆苷元前体药物。