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摘要2型糖尿病(type 2 diabetes melletus，T2DM)为非胰岛素依赖型糖尿病，是由遗传和获得性异常因素共同作用而影响胰岛素分泌和胰岛素敏感性的疾病，主要表现为血糖明显高于正常水平，糖代谢紊乱同时伴随脂肪和蛋白质代谢紊乱。其发病机制与环境因素和遗传因素引起的胰岛素抵抗和胰岛素相对或绝对不足相关。它是一种终身携带的疾病，严重影响了患者的身心健康和生活质量，目前，其治疗手段主要包括饮食控制和锻炼，还有降糖、降脂、降压、抗血小板等对症治疗，尚未能针对性地消除病因，治愈疾病。针对病因的有效预防和治疗仍然是一个全世界面临的难题，需要更深入和清晰地了解T2DM的发病机制。根据WHO最新资料及2003年国际糖尿病联盟(IDF)报告，当前糖尿病发病率迅速增高，已成为现代社会的沉重包袱。 遗传因素是T2DM的重要致病因素，所以寻找敏感的致病基因，深入了解该病预防和治疗的遗传背景是当前需要解决的重要问题。目前，此项研究正在世界范围内积极探讨和进行，迫切需要尽快筛查更多的候选基因，发现有临床意义的相关基因，了解T2DM的遗传背景，充分理解基因环节的发病机制，从而更有效地进行筛查、预防控制和临床治疗。已经发现与该病相关的基因还很少，包括calpaln-10基因、PPARy基因、PGC-l基因、IRSl基因等，以及少数MODY相关基因。目前，用于研究糖尿病相关基因的策略主要包括候选基因法、全基因组扫描法等。候选基因法可选定T2DM发病过程中与糖代谢和信号转导各个环节有关的基因作为研究对象。越来越多的证据显示，雌激素可能影响T2DM的发生。临床发现，更年期妇女卵巢功能减弱，雌激素水平急剧下降，进行雌激素替代疗法能减轻更年期妇女的糖耐量下降和胰岛素抵抗，降低血脂和血糖，改善胰岛素代谢，减少T2DM及其并发症的发生率，说明雌激素有利于治疗T2DM。动物研究则显示，雌激素存在类似胰岛素效应，并提高机体对胰岛素的敏感性，能减轻胰岛素抵抗，降低血糖，提高胰岛beta细胞数量和功能，降低糖尿病的发生率，改善肥胖体形，改善肾病和心功能不全等并发症。总之，雌激素具有抗糖尿病的效应。雌激素主要通过它的受体来介导其各种效应。雌激素受体(ER)广泛存在于胰岛beta细胞、骨骼肌和心肌、脂肪组织等与T2DM发病机制相关的重要部位，这些组织细胞中ER的数量或结构异常，可能导致雌激素效应的异常，从而可能影响T2DM的发生。ER基因转录的效率和正常的表达与ER的数量和结构直接相关，如果ER基因发生突变，改变了受体的转录和表达，可能将影响ER介导的与T2DM发病相关的某些效应。 ER包括ER alpha和ER beta及其它未确定的受体亚型。已经检测到不少的ER多态性，ER基因多态性与多种疾病相关。目前研究显示，多数雌激素的效应都由ER alpha参与介导，不仅细胞核内存在ER alpha，细胞膜上也存在ER alpha。如果ER alpha基因发生功能性的变异导致ER alpha受体表达异常，将会直接减弱ER alpha受体所介导的效应，可能影响前述各机制的单个及多个联合效应，影响T2DM的发生，从而成为T2DM的致病基因。因此，ER alpha受体基因可以作为T2DM机制研究的敏感候选基因。 临床上一些妇女体内雌激素水平不低，但仍然发生T2DM，可能是与ER alpha基因变异使受体表达量减少，导致雌激素效应减弱，不能改善糖耐量的损伤和胰岛素抵抗等有关系。ER alpha基因的l号内含子中含有增强子、启动子等重要调节序列，研究显示其内的PvuⅡ、Xbal内切酶切割位点可能对ER alpha的表达和功能有明显影响，ER alpha基因型不仅通过受体水平而且在激素合成水平影响到ER alpha的生物学效应，明显降低突变基因型个体的受体表达量，从而使个体中雌激素的效应大大减弱。ER alpha基因的其它多态位点研究较少，发现具有明显功能影响的突变点很少。由于PvuⅡ、XBAl内切酶切割位点的功能相对较为明确，因此对于该基因的功能突变与疾病的关系研究主要利用这两个位点进行观察。目前，ER alpha基因的PvuⅡ、Xbal限制性酶切位点多态性(restriction fragment 1ength polymorphism，RFLP)与T2DM的关系尚未清楚，国外仅有一篇小样本病例一对照的研究报道(49例T2DM，138例正常人)，年龄差异大，也没能进行性别分层研究：国内仅有一篇分析T2DM病人和该位点关系，缺乏健康对照人群。 因此研究尚未清楚，需要进行大样本研究及不同种族人群的比较。病例和健康对照人群的收集是该研究的一个难题，这可能是目前缺乏证据报道的原因之一。 研究显示，ER alpha可与胞膜微囊区的caveolin-3(C1n-3)结合，共同定位于微囊结构。微囊(caveolae，Cle)是细胞膜上直径约50-100jxm的囊状小凹，参与膜的交通、排列、传送和信号转换功能。微囊含有丰富的微囊蛋白(又称窖蛋白，caveolin，C1n)，目前发现的C1n家族成员主要有caveolin-1(C1n-1)，caveolin-2(C1n-2)及caveolin-3(Cln-3)，C1n—l和Cln-2在全身大多数组织细胞如脂肪细胞、内皮细胞、纤维原细胞等都有高丰度表达，而Cln-3的表达仅限于肌组织(Muscle tissue)，如骨骼肌、心肌和平滑肌，所以称它为M-caveolin。研究提示，肌细胞Cln-3具有划分信号分子的区域和调节一些信号分子的功能，包括eNOS、肾上腺素能受体、蛋白激酶C单体、G蛋白、Src家族激酶和肌营养不良素-糖蛋白复合体等多种信号分子。在雌激素作用下，细胞膜上的ER alpha能调节信号分子内皮源性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性，这种调节作用与肌细胞膜微囊上的Cln-3有关，说明雌激素的活动与肌细胞膜上的Cln-3有关。引人注意的是，微囊区蛋白Cln-3与糖尿病发病机制也有着紧密联系。 研究表明，Cln-3在肌肉肥大和营养不良，以及脂肪和糖代谢中都具有重要意义，Cln-3的基因突变致骨骼肌营养不良性肌病和心肌病的发病,C1n-3基因敲除可直接引起小鼠胰岛素抵抗。配体依赖的胰岛素受体(IR)定位于细胞膜微囊，IR和它的下游调节子胰岛素受体底物1(IRSl)的信号转导，是肌组织中糖吸收机制的关键部分，IR及IRSl的活动需要微囊中Cln-3的配合，其膜定位和信号转导可能受到C1n-3的调控，Cln-l和Cln-3与IR共转染能刺激体内IRSl的磷酸化。此外，一些肌细胞内的研究证据显示，Cln-3与细胞糖代谢的一些关键酶和能量生成的关键环节密切相关。这些发现提示Cln-3的功能与胰岛素作用的糖代谢机制密切相关，在体内葡萄糖平衡以及胰岛素抵抗的发展中起到重要作用，与T2DM的肌细胞糖代谢密切相关。 如果Cln-3基因发生的功能性或表达量的变异，可能导致上述环节的破环，即不仅破坏ER alpha的糖尿病相关效应，而且直接破坏肌细胞的C1n-3蛋白与T2DM相关的糖代谢及能量代谢，从而影响T2DM的发生发展。此外，由于C1n-3是肌细胞膜上的信号转导枢纽，可能影响到细胞内外许多信号分子的定位和信号传递，因而影响到很多的信号通路的正常运转，导致细胞代谢严重紊乱，因此我们从功能上分析，C1n-3基因突变很可能增加携带者对T2DM的易感性。目前，Cln-3基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)与T2DM关系的研究在国内外未见报道。 ER alpha可能通过一些重要途径影响T2DM的发生，其膜信号结合分子Cln-3蛋白也与T2DM有密切关系，因此ER alpha基因和C1n-3基因是T2DM的敏感候选基因。ERalpha基因与T2DM的关系研究中，国外和国内少数报道中样本量均较小，年龄跨度太大，且未按性别和年龄进行分层分析，因此结论不能明确。此外，该研究需要更多样本和不同地区的证据。 本研究主要包括两部分内容： 第1部份 ER alpha基因SNPs与T2DM关系的研究 在中国广州市51-70岁人群中，了解ERa基因SNPs多态性，通过病例-对照研究等方法研究ERa基因SNPs是否与T2DM相关： 1．收集临床资料及血样； 2．从血中白细胞核提取人基因组DNA： 3．通过PCR-RFLP分析ER alpha基因Pvrll及Xbal酶切多态性在T2DM及正常人中的分布及差别； 4．分析正常对照人群Pvull及Xbal酶切多态性与血糖、血脂水平的关系。 5．结合其它研究结果，综合分析ER alpha基因是否T2DM发病相关。 第2部份 Caveolin-3基因SNPs与T2DM关系的研究 在中国广州市人群中了解C1n-3基因SNPs多态性，通过病例一对照方法研究Cln-3基因多态性是否影响T2DM的发生： 1．收集临床资料及血样； 2．从血中白细胞核提取人基因组DNA： 3．通过PCR-SSCP初步了解部分T2DM病人C1n-3基因的突变情况； 4．直接测定T2DM及正常对照样本的基因片断序列； 5．比较这些多态位点在T2DM及正常人中的差别，分析Cln-3基因是否与T2DM发病相关。