检索历史 清除

摘要Peptaibols是一类由非核糖体肽合成酶(NOn-Ribosomal Peptide Synthetases，NRPSs)合成的富含α-氨基异丁酸(Aib)、具α-螺旋结构，对细菌、真菌等有拮抗作用的一类特殊的抗菌肽。Peptaibols具有独特的结构特点：含有高比例的非蛋白质氨基酸残基，尤其是富含α-氨基异丁酸(Aib)；烷基化的N-末端(通常乙酰化)和C-末端羟基化的氨基酸。Aib残基的存在有利于形成α-螺旋结构，所有现在已知的peptaibols都是高度螺旋化的，脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)则促使螺旋的弯曲(bends)或结节(kinks)的形成。Peptaibols两亲性的结构特性使多个分子在脂双层膜上能够形成电荷依赖的离子通道。但是到目前为止只有单体分子的晶体结构被解析，因此只提出了其与脂膜相互作用的模型。目前对于peptaibols的研究也主要集中在对其结构的解析和其与拟态膜的相互作用方面，而对于其抗菌性质、抗肿瘤活性及其作用机制却缺乏深入而广泛的研究。现已发现的317种peptaibols中有190种来源于木霉菌株。木霉菌是一种广泛存在于土壤、植物根际和叶面的腐生型真菌，对于多种植物病原真菌具有抑制作用，是一种重要的商业化生防因子。本课题组在对木霉生防因子Trichodermakoningii SMF2的研究过程中发现其能产生耐热性的抗菌物质，且该抗菌物质对多种土传真菌具有拮抗作用。在此研究基础上，本文分离纯化鉴定了该抗菌物质，并对其抗菌性质及抗肿瘤活性进行了系统地研究。 1.康宁霉素的分离、纯化和鉴定。采用分子筛层析技术部分纯化了T. koningii SMF2产生的抗菌物质，采用高效液相色谱技术对其进行了进一步分离纯化，结合抗菌活性测定，发现峰1，2和3的三个组分具有抑菌活性。采用液质联用(LC-ESI-MS)技术对三个组分进行了鉴定，三种抗菌活性物质鉴定为’rrichokonins(TrichokoninⅥ，Ⅶ和Ⅷ)，定名为康宁霉素。 2.康宁霉素的抗菌性质研究。测定了康宁霉素的抑菌谱，表明康宁霉素对于革兰氏阳性细菌及多种植物病原真菌具有抑制作用，但对革兰氏阴性细菌没有作用。测定了康宁霉素对于金黄色葡萄球菌及一株临床分离的多抗金黄色葡萄球菌的MIC值均为25μM，时间杀菌曲线表明在MIC药物浓度下康宁霉素对二者的抗菌活性明显不同。在含MIC浓度康宁霉素的培养基中多次传代培养后，二者对药物的敏感性发生了明显的变化。 3.康宁霉素的抗肿瘤活性检测。选取了有代表性的三株肿瘤细胞系：肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2及胃癌细胞BGC823作为受试细胞，初步研究了其抗肿瘤活性。MTT实验表明，康宁霉素对三者有着强烈的生长抑制作用，IC50值均在25μM左右。康宁霉素具有明显的肿瘤细胞毒性，很有可能成为有效的抗肿瘤候选药物。荧光染色观察的结果则表明：康宁霉素对三株细胞的生长抑制有所不同，各自表现出不同的特征。 4.研究了康宁霉素对HepG2细胞生长抑制的机理。通过MTT实验，发现康宁霉素Ⅵ对HepG2细胞具有剂量依赖性的强烈抑制作用。实验结果表明：康宁霉素Ⅵ诱导的细胞死亡具有paraptosis(副凋亡)的一些特征，如细胞大量死亡、线粒体破坏、以及胞质不均质化并伴有大量空泡的形成。同时，细胞死亡伴有DNA降解为较大片段以及线粒体跨膜电势的破坏。研究表明康宁霉素Ⅵ可形成跨膜Ca<'2+>通道，因而很可能导致HepG2细胞胞内Ca<'2+>浓度的迅速升高。Westernblot检测发现，康宁霉素Ⅵ诱导的细胞死亡过程中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达水平下降，而caspase-9前体剪切为活性形式，同时，caspase下游底物PARP也被激活；对细胞的生长抑制作用可被caspase特异性抑制剂z-VAD-fmk所抑制。综合上述结果，康宁霉素Ⅵ可诱导细胞进入一种caspase依赖性的新型paraptosis程序性细胞死亡过程，且该过程中Ca<'2+>具有重要作用。