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摘要研究目的: CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞(Treg)是近来发现的具有强有力免疫负调节作用的T细胞重要类型之一。最近研究显示，Treg参与多种途径诱导的移植免疫耐受<'[1]>。因此深入研究影响和调控Treg活性的因素及其机理，对诱导移植耐受，从根本上解决临床器官移植排斥问题，具有重要意义。然而目前临床广泛应用于器官移植的免疫抑制剂对CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的影响及其机理尚不明确。Rapamycin(雷帕霉素，Rapa)作为一种新型大环内酯类免疫抑制剂，其独特的免疫抑制作用在器官移植领域已经受到高度重视。近来研究报道Rapa在体外可以选择性地扩增正常小鼠的天然CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞，而不阻断该小鼠CD4<'+>T细胞的扩增和活化诱导细胞凋亡，但其确切机制尚不清楚<'[2]>。此外，有研究报道，IL-2作为一种经典的T细胞生长因子，同时也调控调节性T细胞诱导免疫耐受的过程，影响调节性T细胞的功能并维持其竞争适应性<'[3]>。但是在移植耐受诱导过程中IL-2与Rapa之间有无相互作用尚不清楚。 本实验室前期研究发现，在传统免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)诱导的同种移植耐受模型中，CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>表达升高，并与移植物生存时间呈正相关。但是Rapa是否也影响同种移植个体的Treg活性，能否在体外扩增移植耐受模型的CD4<'+>CD25<,+>调节性T细胞并保持其免疫抑制活性方面，目前尚未见研究报道。本实验采用小鼠同种皮肤移植模型，以Rapa/CsA对同种移植模型进行耐受诱导。研究Rapa体外对移植耐受模型中CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<,+>Treg活性的影响。同时研究在不同剂量IL-2存在条件下，Rapa介导同种皮肤移植免疫耐受的有效方式和使用剂量，并研究经Rapa处理的耐受模型的CD4<'+>T细胞对介导过继移植免疫耐受的应用效果。实验方法以B6小鼠为供体，BABL/c和BABL/c-SCID小鼠分别为受体，建立小鼠同种皮肤移植模型。移植术前一天供体脾细胞预先注射，移植后BABL/c小鼠分别给予免疫抑制剂Rapa(0.5mg/kg)或CsA(10mg/kg)腹腔注射进行耐受诱导。移植后第14天提取耐受诱导的BAN/c小鼠脾细胞(术后第14天对照组移植皮片全部排斥)，纯化T细胞和CD4<'+>T细胞，经不同浓度Rapa和/或IL-2体外处理后，通过MLR确定T细胞特异性回忆反应；流式细胞术检测CD4<'+>CD25<'+>Treg细胞比例变化；RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达情况；ELISA检测T细胞培养上清中IL-10浓度的变化。然后将经过Rapa体外处理的CD4<'+>T细胞过继转输给BALB/c-SCID小鼠同种移植模型，逐日观察移植物存活状态。 实验结果: 1.与对照组相比(13.2±1.5 d)，移植后体内应用雷帕霉素加供体脾细胞预先注射，移植皮片存活期明显延长(22.8±2.1d)，P<0.05。CsA加供体脾细胞预先注射，移植皮片存活期也明显延长(22.0±1.9d)，与Rapa处理组相比无显著差异，但是小鼠的一般状况较差，体重明显下降。 2. 移植耐受模型鼠的T细胞经Rapa体外处理不同时间(24、48、72、96h)后，与未处理组相比，Rapa单独处理在第72h可以使T细胞特异性增殖水平降低，联合IL-2共同处理时T细胞特异性回忆应答反应最弱。同期T细胞培养上清中IL-10水平与T细胞特异性回忆反应的变化一致。 3. 移植后第14天耐受模型组提取的T细胞或CD4<'+>T细胞经低浓度Rapa(100nM)体外处理72h后，与未经Rapa处理的对照组相比，CD4<'+>CD25<'+>T细胞数量增多，Foxp3表达量增加，而联合低浓度IL-2(50IU/ml)后其上调CD4<'+>CD25<'+>T细胞数量的比例较二者单独应用均明显提高。 4.耐受模型小鼠脾CD4<'+>T细胞经Rapa体外处理后再过继转输给同种移植的BALB/c-SCID鼠后，其移植皮片存活时间显著延长(P＜0.05)。 结论: 1．体内应用Rapa或CsA加供体脾细胞预先注射均可明显延长同种移植皮片的存活时间，诱导移植耐受，Rapa效果优于CsA。 2．Rapa，体外处理同种移植耐受模型鼠T细胞和CD4<'+>T细胞的有效使用剂量是100 nmol/L，最佳作用时间是72 h。 3．Rapa在体外可以扩增移植耐受模型中CD4<'+>CD25<'+>T细胞的数量，增加Foxp3表达量，低浓度IL-2(50IU/ml)可以协同增强Rapa这一作用。 4．Rapa诱导的Treg其功能的发挥不依赖于IL-10的产生，但其功能的激活有赖于IL-2的存在。 5．耐受诱导产生的CD4<'+>CD25<'+>Treg，经Rapa体外处理后过继转移，仍保持其免疫负调节作用，明显延长同种移植物存活时间。