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摘要本实验研究低氧和高氧肺损伤情况下，大鼠AFC在不同时期的变化情况，并探讨肺脏超微结构的改变和AFC变化之间的内在联系。并研究β<,1>及β<,3>肾上腺素能受体激动剂对肺损伤大鼠AFC的作用及其作用机制，旨在为治疗肺水肿提供新的思路。 实验研究方法： 一、材料： 动物：雄性wistar大鼠(体重300-380克，由中国医科大学第二临床学院实验动物中心提供合格证号：SYXK(辽)2003-0019)，透射电镜(H-600)，数字式测氧仪(浙江省建德市利达仪器厂)，水浴箱(上海跃进医疗器械厂GB11241-89)，分光光度仪(日本岛津公司UV160A)，烤箱(上海跃进医疗器械厂)。 药物：β<,1>肾上腺素能受体激动剂地诺帕明由日本Tanabe药物有限公司惠赠，β<,2>肾上腺素能受体激动剂特布他林、β<,3>肾上腺素能受体激动剂BRL-37344、CGP-12177、β<,1>受体阻滞剂Atenolol、β<,2>受体阻滞剂ICI-118551、β<,3>受体阻滞剂SR-59230A、钠通道阻断剂氨氯吡咪、Na<'+>-K<'+>-ATP酶阻断剂哇巴因、秋水仙碱及秋水仙碱的衍生物β-光秋水仙碱、Evans蓝均购于美国Sigma公司，牛血清白蛋白购于北京舒伯伟化工仪器有限责任公司。 二、研究方法： 1、大鼠动物模型的制备： (1)高氧致肺损伤大鼠动物模型的制备：雄性wistar大鼠置于透明玻璃箱中(80cm×60cm×50cm)，以10L/min输入氧气，当氧浓度达到90％后，持续输入氧气2-3L/min，使氧浓度维持在90％±1％，用数字式测氧仪监测箱内氧浓度。用钙石灰吸收CO<,2>,温度25-26℃，大鼠自由摄取食物和水。正常对照组大鼠置于室内空气中，氧浓度21.0％，饲养条件与高氧组相同。 (2)低氧致肺损伤大鼠动物模型的制备：雄性wistar大鼠置于透明玻璃箱中，以10L/min输入氮气，当氧浓度达到10％后，持续输入氮气0.5-1.5L/min，使氧浓度维持在10％±q：1％，用数字式测氧仪监测箱内氧浓度。饲养条件与高氧组相同。 2、指标测定： (1)AFC的测定：将大鼠用10.0％水合氯醛0.03ml/10g体重进行腹腔麻醉，气管切开后进行气管插管。腹主动脉放血处死大鼠，将气管、肺、心脏全部取出。用保鲜膜包被后放入37℃水浴箱中孵育。通过气管导管将Evans蓝(0.15mg/ml)标记的5％白蛋白等渗生理盐水溶液以5ml/kg体重灌入大鼠气管内。并给予4ml的氧气(低氧大鼠给予氮气)以确保灌注液到达肺脏。并且持续给予100％的氧气(低氧大鼠给予100％氮气)，使气道内保持7emH<,2>O的气道压力，孵育1h后通过分光光度仪，在波长620nm处测定Evans蓝标记的白蛋白浓度。AFC计算公式如下:AFC=[(Vi-Vf)/Vi]×100，Vf=Vi×Pi/Pf,式中Vi和Vf分别代表起始和最终肺泡液体总量，i表示灌注前，f表示孵育1h后吸出的肺泡灌洗液体积。P是Evans蓝标记的白蛋白浓度。 (2)肺组织含水量测定：TLW的测定采用Noble法并加以改进<'[7]>，公式：TLW=(肺湿重-肺干重)/肺干重。 3、分组将动物随机分组，每组动物10只，共48组。 (1)分别测定低氧肺损伤及高氧肺损伤大鼠总肺水量(TLW)，AFC并取病理进行肺组织形态结构观察。 (2)地诺帕明对低氧肺损伤大鼠．AFC的作用及其作用机制：分别将不同药物灌入低氧肺损伤大鼠肺泡腔内，孵育1h后，检测灌注液白蛋白浓度，计算．AFC。 (3)CGP-12177和BRL-37344对高氧肺损伤大鼠AFC的作用及其作用机制：分别将不同药物灌入高氧肺损伤大鼠肺泡腔内，孵育1h后，检测灌注液白蛋白浓度，计算AFC。 三、统计学处理数据以x±s表示，采用GraphPad Prism 4.0统计软件，多组数据比较采用ANOVA和Student-Newman-Keuls检验方法统计分析。 实验结果 一、病理改变 1、高氧24h大鼠可见肺泡周围血管轻度扩张、淤血；毛细血管内皮细胞膜明显增厚。高氧48h大鼠可见肺泡周围血管扩张、淤血加重；肺泡Ⅱ型上皮细胞并无明显结构的变化；毛细血管内皮细胞出现损伤性改变。高氧72h大鼠可见到肺间质增宽、淤血，并有肺出血及较多水肿液形成；透射电镜可见到肺泡Ⅱ型上皮细胞结构的破坏。 2、低氧48h大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞除微绒毛的倒伏，排列混乱外无明显的结构变化，至72h肺泡Ⅱ型上皮细胞出现损伤改变。 二、TLW及AFC的变化情况 高氧和低氧24h TLW明显高于对照组大鼠TLW,且随着高氧和低氧暴露时间的延长而增加。但是高氧24h(19.0±3.30％)、48h(16.44±3.41％)、低氧24h(18.7+3.19％)大鼠AFC与各对照组大鼠AFC比较差异并没有显著性。 三、β<,1>受体机动剂对低氧大鼠AFC的作用 地诺帕明能明显增加正常及低氧大鼠AFC，10<'-5>mol/L特布他林与10<'-5>mol/L地诺帕明对低氧48h大鼠AFC的作用比较差异没有显著性。地诺帕明增加AFC的作用能被atenolol完全抑制，不能被ICI-118551抑制。氨氯吡咪和哇巴因均能抑制地诺帕明对低氧大鼠AFC的作用。秋水仙碱能够明显抑制地诺帕明对低氧大鼠AFC的作用，秋水仙碱衍生物β-光秋水仙碱则无此作用。 四、β<,3>受体机动剂对高氧大鼠AFC的作用 10<'-7>mol/L至10<'-4>mol/L的BRL-37344能够明显升高高氧大鼠AFC，而CGP-12177只有10<'-6>mol/L和10<'-5>mol/1．，浓度能使高氧大鼠AFC明显升高。三种选择性β受体阻滞剂atenolol、ICI-118551、SR-59230A和CGP-12177联合作用高氧大鼠AFC的结果为16.54±2.67％，与β<,3>受体阻滞剂SR-59230A和CGP-121771联合作用(17.5±2.90％)比较差异没有显著性。BRL-37344对高氧大鼠．AFC的作用能够被ICI-118551和SR-59230A抑制。氨氯吡咪及哇巴因能够明显抑制CGP-12177和BRL-37344对高氧大鼠AFC的作用。 研究结论： 1、轻度肺水肿时，虽然总肺水量增加，但肺泡液体清除率可以不降低。毛细血管内皮细胞比肺泡上皮细胞更容易受到损伤。肺泡液体清除率降低时未必一定出现肺泡上皮细胞形态结构的明显变化。 2、β<,1>肾上腺素能受体激动剂地诺帕明可以提高肺损伤大鼠的肺泡液体清除率。地诺帕明提高AFC的作用可能与其促进Na<'+>-K<'+>-ATP酶从细胞内向细胞膜的转运有关。β<,1>肾上腺素能受体激动剂为肺水肿的治疗提供了更多的选择。 3、β<,3>肾上腺素能受体激动剂CGP-12177和BRL-37344可以提高肺损伤大鼠的肺泡液体清除率。CGP-12177是高选择性β<,3>肾上腺素能受体激动剂，而BRL-37344兼具激活β<,2>和β<,3>两种肾上腺素能受体的功能。β<,3>肾上腺素能受体激动剂为肺水肿的治疗提供了更多的选择。