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摘要本研究以产毒真菌黄曲霉(Aspergillus flavus)的基因组DNA为模板，根据黄曲霉毒素生物合成中关键酶的基因序列设计引物，构建了能够从样品中快速灵敏检测潜藏性产毒真菌的多重PCR检测体系，并改进了真菌DNA样品的提取方法，使之适于大量样品检测的真菌DNA快速提取要求。 多重PCR检测体系的构建根据黄曲霉毒素生物合成中关键酶的调控基因aflR、omt-1和ver-1的序列以及真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列分别设计出ApaF/ApaR、OmtF/OmtR、VerF/VerR及ITS1/ITS4等四对引物，用于构建快速灵敏检测饲料或食品中潜藏性产毒真菌的多重PCR反应体系。PCR扩增的四个DNA片断分别为1032 bp、797 bp和600 bp，与基因库中对应基因或DNA序列的同源性达99％以上，仅452 bp片段与对应基因ver-1的同源性为98％。通过优化反应体系的组成因子，建立了单管多重PCR反应体系并应用于6种曲霉和1种青霉的多个菌株DNA样品的检测。结果显示，四个目标片段均清晰地出现在2株黄曲霉和l株寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)的DNA样品中，而其余非产毒菌种的DNA样品中只能检出ITS片段，说明检测特异性十分理想。灵敏性分析结果表明，多重PCR检测的保守灵敏度为1 ng μL<'-1>样品：DNA，且所有目标片段的条带均很清晰；即使DNA浓度降低至0.1 ng μL<'-1>，除aftR之外的所有条带也可分辨。 样品DNA提取方法改进通过比较研究常用的液氮研磨法、酶解法和试剂盒法，根据破壁原理和操作步骤的特点，开发出基于超声波和化学试剂Tris饱和苯酚协同作用的菌丝细胞壁破碎法，辅以煮沸-冰冻处理，使胞内DNA充分释放于缓冲液中。这一改进的样品基因组DNA提取法具有操作简便、经济快速的特点，所获样品经多重PCR扩增，各电泳条带清晰。从DNA样品制备到多重PCR结果检出仅需5 h，符合快速灵敏可靠的检测要求。