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摘要第一部分GFP转基因小鼠神经干细胞的体外培养、纯化及鉴定 目的:建立绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠大脑皮质神经干细胞的体外培养方法。 方法:分别取孕E12～14d和E16～18d的绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠，同时以ICR小鼠作为对照，将大脑皮质制成单细胞悬液，以2.5×10<'8>/L接种于6孔培养板里，培养液中添加1％的N2和20 μg/L的bFGF。倒置显微镜下每天观察其生长状态。 结果:原代培养1～2d后神经干细胞分裂增殖形成神经球，5～6d时神经球逐渐增大，细胞之间结合更加紧密，中央有少量坏死。GFP转基因小鼠与ICR小鼠胚胎来源的神经干细胞，无论生长方式，克隆球数量，还是克隆球直径都没有明显差异。E16～18d小鼠皮质培养的神经干细胞无论克隆球数量还是直径都明显小于E12～14d者(P<0.05)。免疫组化结果提示，培养的克隆球呈Nestin染色阳性。 结论:1．E12～14d小鼠皮质来源的神经干细胞增殖和传代能力明显强于E16～18d者；2．GFP不影响小鼠神经干细胞的生长；3．免疫组化染色结果显示所培养的细胞为神经干细胞。 第二部分嗅鞘细胞的体外培养、纯化及鉴定 目的:建立新生小鼠嗅球嗅鞘细胞的体外培养方法，并观察其形态学及免疫细胞化学特性。 方法:取新生1～2d ICR小鼠的嗅球，去除脑膜，综合运用差速贴壁、阿糖胞苷抑制、丝裂原刺激等方法以达到纯化嗅鞘细胞的目的。利用P75NTR阳性细胞的百分比来评价嗅鞘细胞的纯度。相差显微镜观察其形态学变化。 结果:体外培养的新生小鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞，其突起细长。未经纯化培养，成纤维细胞生长迅速而占据优势，而纯化培养后其纯度可以达到88.7％以上，污染细胞中有星形胶质细胞(少于3％)、神经元(少于1％)、少突胶质细胞(少于1％)和成纤维细胞。免疫组化结果提示，嗅鞘细胞呈P75NGFR和CNPase免疫阳性，GFAP和Nestin阴性。 结论:综合运用差速贴壁、阿糖胞苷抑制和丝裂原刺激的方法可以获得较纯的嗅鞘细胞。 第三部分嗅鞘细胞体外促进神经干细胞增殖及分化的实验研究 目的:探讨体外培养的嗅鞘细胞是否具有促进神经干细胞增殖及分化的能力。 方法:嗅鞘细胞与神经干细胞分别进行共培养和共培养液培养。观察神经干细胞的增殖和分化规律。 结果:4d后共培养组及共培养液组，神经干细胞细胞数量明显比对照组增多(P<0.05)，此时各组间分化情况没有差异。7d后，共培养组神经干细胞的数量达到顶峰，明显高于其余两组(共培养组>共培养液组>对照组，P<0.05)；对照组的GFAP阳性细胞绝对数和百分比明显高于4d时(P<0.05)；共培养组神经干细胞分化为GFAP和CNPase的阳性细胞绝对数较4d时显著增加(P<0.05)，并高于共培养液组和对照组(共培养组>共培养液组>对照组，P<0.05)：共培养液组神经干细胞分化为CNPase的阳性细胞绝对数和百分比较4d时显著增加(P(0.05)，并高于对照组(P<0.05)。 结论:1．嗅鞘细胞通过共培养或共培养液培养可促进神经干细胞增殖；2．随时间延长，对照组的神经干细胞倾向于向星形胶质细胞分化：3．共培养液培养促进神经干细胞向少突胶质细胞分化。 第四部分嗅鞘细胞及其表达的NGF和BDNF促进神经干细胞增殖分化的机制探讨 目的:初步探讨嗅鞘细胞体外促进神经干细胞增殖分化的机制。 方法:利用RT-PCR技术和免疫细胞化学技术对嗅鞘细胞和神经干细胞表达的细胞因子及其受体进行定性研究。共培养液培养2d后，分别对这些细胞因子和受体进行半μ定量PCR研究。在培养液中添加NGF和BDNF抗体以封闭它们的信号通路，借此观察NGF和BDNF对神经干细胞增殖分化的影响。 结果:RT-PCR结果显示，嗅鞘细胞稳定表达B-NGF、BDNF、PDGF-B、bFGF、EGF和trkB的mRNA，而不表达NT-4：神经干细胞可稳定表达B-NGF、BDNF、PDGF-B、trkA和trkB的mRNA，而不表达NT-4、bFGF和EGF的mRNA。免疫细胞组化嗅鞘细胞成NGF、BDNF和P75NTR染色阳性。共培养液培养2d后，神经干细胞PDGF-B(P<0.05)、trkA和trkB mRNA的相对量上调，嗅鞘细胞NGF和BDNF mRNA的相对量有所增加。提示嗅鞘细胞分泌的NGF、BDNF可能通其受体trkA、trkB而影响神经干细胞的增殖分化。NGF或BDNF抗体封闭后，没有对神经干细胞的增殖造成影响，但是二者都能增加星形胶质细胞的数量(以BDNF抗体封闭最为显著，P<0.05)，并减少少突胶质细胞数量(以NGF抗体封闭最为显著，P<0.05)。表明嗅鞘细胞分泌的NGF和BDNF对神经干细胞增殖没有影响，但可能影响其向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。 结论:1．嗅鞘细胞能旁分泌和自分泌大量细胞因子；2．神经干细胞可表达神经营养因子及其受体；3．共培养液培养2d后，嗅鞘细胞与神经干细胞之间可能通过NGF、BDNF和其受体trkA、trkB发生关联相互影响；4．NGF或BDNF在不同的共培养体系中，可以起到减少神经干细胞向星形胶质细胞分化，增加少突胶质细胞分化的作用，而对神经元的分化没有影响。