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摘要Tyro 3亚家族受体酪氨酸激酶(RTKs)包括Tyro 3，Axl和Mer三个成员，它们广泛表达于哺乳动物的神经、免疫、生殖、血管和造血等多种组织中，在精子发生、免疫调节、血小板功能、NK细胞的分化以及血管发生中发挥重要的作用。本论文主要研究Tyro 3亚家族受体在造血中的功能。首先采用免疫细胞化学以及RT-PCR等方法鉴定了Tyro 3亚家族受体在骨髓造血各谱系细胞中的表达，包括巨核细胞、B淋巴细胞前体细胞、红系细胞等。其中巨核细胞表达Tyro 3，Axl，Mer三个受体，而B系前体细胞、红系细胞只表达Axl和Mer。进而利用Tyro 3亚家族受体的单基因、双基因和三基因敲除小鼠为模型研究了Tyro 3亚家族受体在调节骨髓各谱系造血细胞分化中的功能。 1.Tyro 3亚家族受体调节止血与巨核细胞的发生对基因敲除小鼠的分析发现Tyro 3亚家族受体三基因敲除(Tyro 3<'-/-> Axl<'-/-> Mer<'-/->，TAM)小鼠中出现血小板减少症，但是单基因敲除(Tyro 3<'-/->，T；Axl<'-/->，A； Mer<'-/->，M)和双基因敲除(Tyro 3<'-/-> Axl<'-/->，TA；Tyro 3<'-/-> Mer<'-/->，TM； Axl<'-/-> Mer<'-/->，AM)鼠血小板水平保持正常水平；TAM小鼠中血小板降低是由于骨髓巨核细胞发生异常引起的，不仅骨髓巨核细胞数量明显减少，而且含低倍体染色体的巨核细胞比例增多：前血小板形成(proplatelet fomation，PPF)实验表明很少TAM巨核细胞能形成前血小板，表明TAM骨髓巨核细胞有终木分化受阻；超微结构分析进一步证实了这一结果，TAM巨核细胞的胞浆界膜系统不发达并有许多大空泡。AM小鼠骨髓巨核细胞的发生也有明显的异常但是并表现出血小板减少症，可能与髓外巨核细胞发生的代偿有关。双基因和三基因敲除小鼠表现出明显的止血功能障碍，主要原因是由血小板功能异常引起的，双基因和三基因敲除小鼠的血小板聚集和血小板ATP释放能力明显降低。单基因敲除小鼠的止血功能虽然正常，但是血小板功能已经有轻度的缺陷，说明Tyro 3亚家族受体在调节血小板功能时有协同作用。 2.文中发现Tyro 3 RTKs调节B细胞的发育除了调节巨核细胞的发生外，还发现Tyro 3亚家族受体在调节骨髓B淋巴细胞的发生发挥重要的作用。TAM小鼠出现严重的B细胞发生缺陷，D亚群、E亚群B细胞前体细胞的绝对数都少于正常的50％，而F亚群的成熟B细胞数量少于正常的90％。双基因敲除的AM小鼠与TAM小鼠表型相似，表现出严重的B细胞发育障碍，但是TA、TM小鼠的各个亚群B细胞数量跟正常的没有明显的差异。单基因敲除小鼠除了T小鼠外，A和M小鼠的B细胞发育出现了明显的改变，但是表型不同，A小鼠主要表现为Pre-B细胞缺陷，而M小鼠主要以成熟B细胞降低为主，说明了Tyro 3亚家族受体在调节骨髓B淋巴细胞发生的不同阶段发挥作用。利用卵清白蛋白(OVA)蛋白作为抗原免疫小鼠以观察不同基因小鼠对TD型抗原的免疫反应。初次免疫时，A、M和TAM小鼠OVA特异的IgM和IgG免疫反应都比正常的低。但是加强免疫时不同基因型小鼠出现了不同的情况。在M小鼠中OVA特异IgM加强免疫反应和正常没有区别，而IgG加强免疫反应却明显降低。A小鼠虽然IgG免疫反应和正常没有显著性差异，而IgM免疫反应却明显降低。TAM小鼠的OVA特异的IgM和IgG加强免疫反应都比正常的低。这些结果显示了Axl和Mer受体在产生抗原特异的免疫反应中发挥中重要作用。 3.在Tyro 3 RTKs调节红细胞的发生过程中，发现Tyro 3亚家族受体在红系造血也发挥重要作用。Axl和Mer单基因敲除小鼠骨髓中Ter119高表达的红系细胞有轻微的降低，然而Axl和Mer联合突变时出现严重的红系发育障碍。AM小鼠骨髓中Ter119高表达晚期成红细胞降低了50％，而早期的Ter119低表达红系细胞反而增加，暗示了Axl和Mer敲除小鼠红系分化发生了部分阻滞。TAM小鼠红系造血的表型和AM小鼠相似，有严重的红系发育障碍。TAM和AM小鼠骨髓的红系发生虽然有明显的障碍，但是十周龄的小鼠中没有发现有贫血现象，这可能与活跃的髓外红系造血的代偿有关。 4.对Tyro 3 RTKs调节巨噬细胞的吞噬功能，虽然以前有研究报道Mer调节巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬，但是没有报道Tyro 3和Axl是否也参与吞噬调节。利用RT-PCR发现巨噬细胞表达Tyro 3亚家族受体的Axl和Mer，但不表达Tyro 3。细胞免疫化学染色也显示一致的结果。吞噬实验分析显示Mer敲除使巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力显著降低，TAM巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力进一步降低。Axl、Tyro 3单基因或者双基因突变对巨噬细胞的吞噬并没有明显的影响，表明了Tyro 3亚家族受体成员在吞噬凋亡细胞中发挥不同的作用。虽然Mer和Axl都参与巨噬细胞的吞噬，但是Mer起了关键的作用，而Axl可能起协调Mer的作用，Tyro 3的作用很小。