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摘要类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因不明的慢性、进展性、自身免疫性疾病。其病理特征为单核细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳形成，以及软骨侵蚀和关节破坏。临床表现为关节对称性疼痛、运动障碍、甚至关节强直畸形致残，以及多脏器受累。目前RA的具体发病机制尚不清楚，多数学者认为，RA是由遗传与环境因素共同作用而引起的一种自身免疫性疾病。 RA在中医学属痹证范畴。“痹”字最早见于《黄帝内经》，其病因据“风寒湿三气杂至”及“邪之所凑，其气必虚”的理论，为“内外合邪”所致。张仲景秉承《内经》之旨，开痹证辨证论治之先河，后世医家多遵从《内经》及《金匮要略》之论痹，结合各自所处历史环境与个人临床经验，从不同角度深入对痹证病因病机的认识，并立法组方遣药，或配以针灸、导引等外治法，使痹证证治丰富多彩，各具特色。而治痹方药之组成、配伍，以及方药之寒热温凉等属性，只有与痹证之“证候要素”、“病机”高度相符，该方药才能获得最佳疗效。这即是痹证“方证相应”理论的研究内容，也是痹证临床辨治的客观要求。 为观察外界环境对痹证证候的影响，验证痹证乃“内外合邪”的病因学理论，并研究治痹方药与痹证证型的相关性及该相关性的生物学内涵，本课题以RA目前最为公认的动物模型，即Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型作为热痹证大鼠模型，采用“人工气候”试验箱进行外界环境的“风寒湿”或“风湿热”干预，再选用治疗热痹证的代表方剂——宣痹汤以及治疗寒热错杂痹证的代表方剂——桂枝芍药知母汤进行交叉治疗干预，进行了有关痹证病因学理论以及痹证“方证相应”理论的动物实验研究。 1．实验用Ⅱ型胶原在Wistar大鼠诱导CIA模型。在二次免疫后，即从第2周开始，M(模型)组大鼠非致炎足(左足)出现炎性改变，其临床体征与人RA体征相似，血清Anti-CⅡ、IgG抗体以及INF-γ、IL-4、TNF-a等细胞因子显著升高，踝关节H-E染色观察发现典型的RA炎症性改变。综合体征及微观生物学指标，可认为CIA造模成功，热痹证模型建立。 2．在CIA造模成功的基础上，采用“人工气候”试验箱，对模型大鼠“风寒湿”(C组)或“风湿热”(H组)干预三周，定量分析大鼠舌象，并观察宏观体征。结果显示，C组大鼠可辨为寒痹证；H组大鼠仍可辨为热痹证，但兼夹瘀血因素。与M组比较，C组IgG抗体、INF-γ、IL-4、TNF-a水平均显著下降，Anti-CⅡ抗体亦下降，H组IgG抗体、INF-γ、IL-4水平显著下降，TNF-a水平亦下降，Anti-CⅡ抗体水平未见明显改变；流式细胞术结果显示，C组Th1、Th1/Th2均显著降低，H组仅见Th1/Th2下降，Th1、Th2所占淋巴细胞比率无明显变化；荧光实时定量(Real-time)PCR技术测定显示，c组T-bet mRNA表达下调，IL-4 mRNA表达显著上调，C组和H组INF-γmRNA表达均下调，差异均具有显著性，但T-bet/GATA-3比值两组均无统计学改变；关节H-E染色后观察显示，H组与M组相似，均病变重，C组病变较轻，偶见炎症细胞浸润。综合宏观体征和微观指标分析表明，“风寒湿”和“风湿热”均能改善Th1/Th2漂移，其中“风寒湿”改善更为明显，但二者对T-bet/GATA-3比值均无明显影响。 3．采用同样的实验技术，对M组CIA大鼠灌胃给予宣痹汤(X组)及桂枝芍药知母汤(G组)三周后显示，两组大鼠血清IgG抗体、lNF-γ、IL-4、TNF-a水平均降低，Thl、Th1/Th2均显著降低，Th2显著上升，T-bet、INF-TmRNA表达显著下调，IL-4 mRNA表达显著上调，T-bet/GATA-3在G组有改变，在X组明显改变。H-E染色显示，G组病变仍较重，X组偶见炎症细胞，病变减轻。此外，使用缺口术端标记法(TUNEL)原位检测关节组织细胞凋亡显示，两组细胞凋亡率均明显下降，但X组更明显。综合宏观体征和微观指标，宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比，前者能更好地治疗CIA大鼠，逆转Th1/Th2漂移，下调T-bet/GATA-3比值。 4．同样，对“风寒湿”干预三周后的CIA大鼠，灌胃给予宣痹汤(C+X组)及桂枝芍药知母汤(C+G组)干预三周，结果显示，C+X组大鼠血清Anti-CⅡ抗体水平显著上升，Th1，Th1/Th2亦显著上升，C+G和C+X组均见IL-4 mRNA表达明显下调，仅C+X组T-bet/GATA-3比值上调。关节HE染色后观察显示，C+X组炎症细胞大量浸润，与M组病变程度类似，而C+G组单核细胞浸润减少，病变减轻。TUNEL原位检测关节组织细胞凋亡显示，与C相比较，C+G组细胞凋亡率下降，C+X组未见明显改变，但镜下观察显示C+X组炎症细胞、纤维细胞增加，细胞凋亡加重。综合宏观体征和微观指标，宣痹汤与桂枝芍药知母汤均未明显改善经“风寒湿”干预三周的CIA大鼠病情，反而，宣痹汤使临床症状、关节局部病变，细胞凋亡恶化，且上调了T-bet/GATA-3比值，加剧了Th1/Th2漂移。 5．此外，对“风湿热”干预三周后的CIA大鼠，灌胃给予宣痹汤(H+X组)及桂枝芍药知母汤(H+G组)三周，结果显示，仅H+G组大鼠血清Anti-CⅡ抗体水平显著下降，H+G组和H+X组Th1、Th1/Th2均显著降低，Th2显著上升，INF-γmRNA表达均下降，另外，仅H+G组GATA-3 mRNA表达上调，T-bet/GATA-3比值下降。关节HE染色后观察显示，H+G组与H组比较，病变减轻，而H+X组病变仍较重。TUNEL法原位检测关节组织细胞凋亡显示，两组细胞凋亡率均未明显改变。综合宏观体征和微观指标，宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比，在改善经“风湿热”干预三周后的CIA临床症状和微观指标方面，后者要优于前者。 综上，“风寒湿”或“风湿热”外界环境干预可导致热痹证CIA大鼠证候改变，并都能改善CIA热痹证大鼠的病情，逆转Th1/Th2漂移，但前者影响更为明显，后者对CIA大鼠关节局部病变无影响。这证明，外界环境对痹证证候演变有一定程度的影响，验证了痹证乃“内外合邪”的病因学理论。另外，宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比，前者与热痹证大鼠的“证候要素”、“病机”更为相符，能更好地治疗CIA热痹证，逆转Th1/Th2漂移，但与寒痹证CIA大鼠的“证候要素”、“病机”相反，使寒痹证大鼠病情恶化，加剧Th1/Th2漂移；桂枝芍药知母汤对寒痹证大鼠病情及Th1/Th2漂移影响不明显，但与热痹证兼夹瘀血因素大鼠的“证候要素”、“病机”更为相符，能更好改善该证型CIA大鼠病情，但二者对，Th1/Th2漂移影响相似。这验证了痹证“方证相应”理论中，只有治痹方药与痹证证候之“要素”、“病机”高度相符，该方药才能获得最佳疗效的正确观点。而且，Th1/Th2细胞亚群漂移程度可能是痹证“方证相应”理论中“方”与“证”符合度在细胞水平的物质基础，T-bet/GATA-3 mRNA表达情况，可能是“方”与“证”符合度在分子水平的物质基础。